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结核分枝杆菌基因疫苗的构建及其免疫学特性的初步研究

范雄林  
【摘要】: 结核病(tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致以呼吸道为主的慢性传染病。目前全球有1/3的人 口感染MTB,每年有1000万的新发病人和300万的病人死亡,表明TB 仍是影响全球人类健康的一个主要公共卫生问题。近年来,耐药结核分 枝杆菌的流行、与HIV的合并感染以及人口流动的增加等因素,进一步 加剧了TB对人类的威胁。卡介苗(BCG)是目前TB唯一的预防性疫苗, 在发展中国家广泛应用,但其保护效果不稳定。另外,BCG接种干扰了 利用PPD对MTB感染的诊断,接种免疫缺陷病人可能导致播散性感染 等缺陷。鉴于BCG自身的不足,以及当前TB流行的严重性,研究更有 效的疫苗具有重要意义。 基因免疫在包括TB的多种传染病的动物模型中可引起体液和细胞 免疫应答。利用质粒DNA真核表达载体,已经有24个MTB抗原被表 达,这些抗原主要来自MTB培养滤液蛋白(CFP)。其中有几个蛋白在 动物模型中显示了较高的保护性,如Ag85复合体、ESAT6、MPT64、 Hsp65和PstS3等。因而基因免疫可能是有希望的用于防治TB的一种有 效方法。 MTB CFP中的蛋白质种类高达800多种。目前从中鉴定保护性抗原 的方法主要是:利用生物化学的方法分离蛋白,以刺激淋巴细胞分泌细 胞因子;利用TB病人血清或MTB感染鼠血清筛检MTB表达文库。 第四军医大学博十学位论文 MTB基因疫茵的研究也可作为一种潜在的研究方法,在体内用于保护性 抗原的筛选鉴定。 为了TB新型疫苗的研究,以及建立快速、有效、廉价的基因免疫 筛选保护性抗原的模式,我们采用 PCR的方法从 MTB H37Ra株基因组 中,扩增出分泌蛋白Ag85B的成熟蛋白的编码基因,用限制性内切酶消 化后,插入克隆载体 pUC中。经酶切鉴定与序列测定证实后,以亚克 隆法构建于真核表达载体pcDNA3的相应酶切位点,再用酶切鉴定证实 相应片段的正确插入。该重组子命名为pTB30m。所测定的序列用Blast 程序检索,表明 MTB H37Ra株Ag85B蛋白的编码基因与结核分枝杆菌 复合体和非结核分枝杆菌相应蛋白的基因高度同源,该序列登录入 Genbank(accession number:AF198032)。将 pTB30m以电穿子法转染 CHO 细胞,并以RTFCR法检测转染细胞中Ag85B特异的mRNA的表达, 初步证实了该质粒可在体外真核细胞中表达:另用该质粒肌注免疫 BALB/c和C57BL历小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果, 证实了该质粒可在体内表达。两种小鼠血清中Ag85B特异性抗体滴度分 别约为1:60和1:80。 为了检测pTB30m质粒免疫小鼠引起的细胞免疫反应,基因免疫完 成后第六周,分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,体外用抗原再刺激,生物学 方法检测 IFN Y产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖反应。pTB30m质 粒免疫的 BALB/c和 C57BU6小鼠脾细胞分泌的 IFN Y的量分别达到 1360ng/ml和 1965pg/ml,生理盐水和空质粒对照组均低于 80 pg/ml;脾 脏淋巴细胞增殖显著,刺激指数分别为3.34和4.23,生理盐水和空质粒 对照组分别为 1.39和 1.sl。 为进一步评价基因免疫的保护性,用 MTB H37RV毒株 SX fCFU 经小鼠尾静脉攻击感染基因免疫的BALB/c ,J’鼠,4W后,脾脏细菌负荷 计数。与生理盐水对照组相比,pTB30m质粒免疫BALB儿 ’J’鼠的脾脏 细菌负荷减少(0.645logl。)CFU(t=8.584,P<0刀05,i=3),而空质粒对照组 仅减少(0刀57log;。)CFU(t=l.334,P>0.20,n=3)。为了证实 T细胞在基因 免疫中的作用,用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T淋巴细胞, 4 第四军医人学博士学位论文 每只 5 XIO‘过继免疫正常 BALB止 ,J’鼠,同时用 MTB $株 10’CFU经 小鼠尾静脉攻击感染,4w后,脾脏细菌负荷计数。pTB30m质粒免疫小 鼠的T细胞过继免疫对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有一定程度的 保护作用0<0刀5,r3.534,n=3人与生理盐水阴性对照组相比,脾脏细菌 负荷减少O.285loglOCFU。而质粒空白对照组脾脏细菌负荷减少 (0.182logl。)CFU(0.10<P<0二0,t=l石37,11=3)。 综上所述,采用编码 MTB H37Ra株 Ag85B成熟蛋白基因的真核质 粒pTB30m基因免疫,是产生抗原特异性的体液免疫反应和保护性细胞


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