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利用噬菌体肽库筛选汉滩病毒受体结合表位的研究

吕欣  
【摘要】: 肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus,HV)引起,以发热、出血和肾脏损害为主要临床表现的急性传染病,我国是世界上受其危害最严重的国家,年发病人数达5~10万人,占世界总发病人数的90%以上。该病病死率较高,目前还没有特异有效的疗法,现有疫苗的免疫效果尚不够理想。 汉坦病毒属布尼亚病毒科,为有囊膜的单股负链RNA病毒,基因组分为大(L)、中(M)、小(S)3个片段,分别编码RNA聚合酶、囊膜糖蛋白(glycoprotein,GP)G1、G2及核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)。GP位于病毒外膜上,在病毒与细胞的结合中发挥作用,中和抗原决定簇主要位于G2上,可刺激机体产生中和抗体;NP可诱导强烈的体液与细胞免疫应答,其上有无中和抗原位点暂无定论。该属病毒初步分为9个血清型,其中Ⅰ型为汉滩病毒(HTNV),76-118株是代表株。我国以HTNV及Ⅱ型汉城病毒(SEOV)为主。 第四军医大学硕士学位论文 一 病毒吸附于宿主细胞表面是病毒感染的始动环节,介导这一过程的是 病毒吸附蛋白(VAP)与病毒受体之问的特异性结合,故阻断两者的结合 即可有效地抑制病毒性感染的发生。病毒受体是存在于宿主细胞表面能被 VAP识别、结合,并利于病毒感染的组分:VAP则存在于有囊膜病毒的 糖蛋白中,它不仅可介导病毒与宿主细胞膜上受体的特异性结合,同时具 有高度的抗原性,也是中和性抗体的靶蛋白。目前,对于HWV的抗原 表位仍不甚清楚,对受体的性质也无定论,因此,明确其宿主细胞上的受 体与病毒上的配体的抗原表位,对了解HTNV在体内的传播方式和发病 机制,以及指导设计抗病毒药物和疫苗都有重要的意义。 病毒受体研究己有40多年的历史,只是在近十几年时间才有较快的 进展。自80年代中期分离出新液病毒和副新液病毒的唾液酸受体至今, 己阐明了HIV,EBV等多种人类病毒受体,并在病毒受体的本质和病毒 与病毒受体间相结合作用的机制等方面取得了很大进展,对病毒研究产生 了深远的影响。但是圃于传统研究方法的局限性,对于多数病毒受体的研 究仍然没有突破。噬菌体表面展示肽库巾hage displayed peptide library) 技术的出现与发展,为病毒受体的研究提供了新的技术手段,并展示出良 好的前景。基于蛋白相互作用中仅几个氨基酸起中心作用的思想,大量的 研究工作显示,在选择合适的配基的前提下,可以筛选出与其特异结合的 短肽。噬菌体表面呈现的短肚不但可模拟线性表位,还可模拟不连续表位、 搪基化表位等。利用单克隆抗体(mAb)淘筛噬菌体肽库,可以得到相应 的抗原或抗原表位,有助于了解病毒受体关键位点的结构和功能,为病毒 受体的鉴定和分离提供有益的线索。库容量越大,筛选出阳性克隆的可能 性就越大,当库容量足够大时,任何一种抗体均可以从中筛选出相应的抗 原表位或模拟表位(motif)。 我室曾利用抗细胞免疫血清法和病its放射材记技术,建立了检测 -4- 第四军医大学硕士学位论文 一 HTNV受体活性的放射兔疫分析技术,并证实在敏感细胞表面存在特异 性HTNV受体,该受体含有对胰蛋白酶敏感的蛋白成分,且在不同HTNV 敏感细胞间,病毒受体分子的构象具有相似性。 本室制各的 HTNV型特异性 mAb 3GI,为一株双特异性 mAb,它既 可与病毒NP结合,又可与GZ结合。其与NP、GP的亲和力不是很高, 但却具有很高的中和及血凝抑制活性,对感染乳鼠的被动保护作用良好, 椎测该抗体与病毒受体的空间构型具有相似性,或其所针对的靶蛋白恰好 是VAP,故可通过竞争或阻断作用抑制VAP与受体的结合。本研究以纯 化的 "LAb 3GI为配基,从噬菌体随机 12肽库中筛选 HTNV的抗原表位, 经3轮淘筛,富集效果明显,所获阳性克隆与mAb 3GI特异结合,经测 序分析,具有保守性序列模式PX(1.2)HX(。-2巾。该基序分别与GZ ’‘YPWH仪KCHY’“ 及 NP 8’PTGVEPGDHLKERSN 相似;又以 PX(1它)HX…二巾为模式,合成了一段10肋(PLARFPHHTHL 利用荧光及 激光共聚焦显微技术检测该短肽与病毒敏感宿主细胞膜的结合活性,观察 到了阳性结果。 以上研究说明该序列具有与HTNV的GZ一段序列相似的特点,并具 有与病毒的敏感细胞膜相结合的特性,有可能是该病毒与受体结合的一段


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