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脑内IL-1受体在免疫应激时的表达变化和IL-6受体的基因克隆及多抗制备

李改丽  
【摘要】: 细胞因子是重要的免疫活性分子,是免疫信息向中枢传递的体液途径中的信号物质,其在神经系统和免疫系统之间的作用愈来愈受到重视。研究细胞因子尤其炎性细胞因子在脑内发挥作用的核团和细胞类型对神经免疫调节机制的研究无疑具有重要的意义。一般认为,细胞因子是通过与细胞表面的相应的高亲和力受体结合发挥其生物学效应的。因而,观察免疫模型动物脑内炎性细胞因子受体表达的变化对揭示脑内参与免疫调控的核团和细胞具有重要的意义。本论文首先回顾了近年来三种炎性细胞因子(IL-1、IL-6和TNF-a)及其受体在脑内分布和表达的研究进展后,分两大部分四个实验,以炎性细胞因子受体作为对象进行了一系列观察和研究。 第一部分 采用不同种类和剂量的抗原刺激,分两个实验,观察了大、小鼠脑内IL-1β的I型受体表达的变化,探讨了脑内参与免疫调控的核团和细胞类型;第二部分 分两个实验,运用PCR技术克隆了大鼠IL-6R的基因并进行了原核和真核表达,制备了特异性高、亲和力强和较高效价的抗IL-6R多克隆抗体,为进一步进行IL-6R的研究奠定了基础。 一、在大鼠腹腔内给予细菌毒素LPS或SEB后,用免疫组织化学方法观察了Ⅰ型IL-1受体在脑内表达的变化。结果显示:Ⅰ型IL-1受体在正常成年大鼠脑内有广泛的表达,隔区、视前内侧区、新皮质、海马、下丘脑室旁核、视上核、下丘脑腹内侧核、弓状核和正中隆起等部位有较多Ⅰ型IL-1受体阳性的细胞。与对照组比较,LPS或SEB腹腔注射后大鼠下丘脑室旁核和视上核中表达Ⅰ型IL-1受体的细胞数量显著增加,染色加深(P<0.05)。阳性细胞的染色面积增大,突起增长。结果提示: 第四军医大学硕士学位论文 下丘脑室旁核和视上核在神经免疫调节过程中可能具有重要的作用。 二、小鼠腹腔内给予细菌内毒素LPS或肠毒素SEB,用免疫组织化 学方法观察了脾脏核增殖抗体及下丘脑室旁核和视上核中1型IL-1受体 的表达,并采用双标记技术观察了1型IL刁 受体阳性神经元和加压素及 催产素表达的关系。结果发现,LPS或SEB引起脾脏核增殖抗体的表达 明显增强(尸<0刀5。f 0刀 1);I型 IL-1受体在正常小鼠脑内的表达很广泛, 与对照组比较,LPS或SEB引起1型几l受体在小鼠下丘脑室旁核和视 上核中表达显著增强(*<O.05。: O.01):在下丘脑室旁核和视上核中1型 ILI 受体阳性的神经元既有加压素能的,又有催产素能的。表明下丘脑 室旁核和视上核可能是脑内参与免疫调节的主要核团,这两个核团中的 部分加压素能神经元和部分催产素能神经元在神经免疫调节中可能具有 重要的作用。 三、用PCR技术,从正常成年大鼠脑的CDNA文库中,获得编码IL6R 基因的序列。测序后,通过PCR扩增和基因重组,分别构建几.6R基因 全长和矮基端部分编码序列的表达载体,并导入大肠杆菌 DHS Q中,通 过IPTG诱导表达重组融合蛋白。对表达的装基端序列编码的融合蛋白过 谷眺甘肽琼脂糖柱进行纯化。结果获得正常成年大鼠IL6RO8叫493 位)的基凶,测序结果与己发表的基因序列相一致。重组L-6R蛋白以 包涵体的形式进行表达。经 SDS-PAGE分析,在相对分于质量(Mr)为 74000和 43000处,各有 1条特异的蛋白带。对竣基端基因表达的包涵体 形式的蛋白进行变性、重折叠及纯化后,得到了高纯度、具有活性的融 合蛋白。 四、利用实验H中得到的IL-6R蛋白免疫新西兰大白兔,制备了抗 IL七R的多克隆抗体;并构建了IL-6R真核表达载体,进行了真核表达, 采用 ELISA、Western blotting及兔疫细胞和组织化学技术对所获得抗体 4 全军神经科学J4[究所 第四军医大学硕士学位论文 进行了鉴定,成功得到了高效价、高特异性和高亲和力的抗IL6R的多 克隆抗体,为下一步关于几-6R的形态和机能研究奠定了基础。


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