山莨菪碱治疗创伤性急性肺损伤分子生物学机制的实验研究

【摘要】： 急性肺损伤(ALI)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性进行性呼吸衰竭，其严重阶段称为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，迄今尚无有效的治疗措施，病死率高达50～70％。肺泡巨噬细胞(PAM)是肺泡腔内的常驻细胞，广泛分布于肺泡内和气道上皮表面，在支气管肺泡局部免疫防御、免疫损害等方面起重要作用。在炎症反应早期，创伤及革兰氏阴性细菌内毒素(LPS)能激活PAM释放以肿瘤坏死因子—α(TNF-α)为主的大量前炎细胞因子，引发机体失控性炎症反应，导致ALI/ARDS发生。核因子—κB(NF-κB)是一种具有多向性转录调节作用的蛋白质因子，能与多种炎症介质(TNF、IL-1、IL-6、IL-8等)基因启动子或增强子中存在的κB序列结合，启动和调节其基因转录，与ALI关系密切。山莨菪碱是从唐古特山莨菪(Anisodus tonguticus)中提取出来的一种生物碱，具有多种生物学作用，临床广泛用于治疗感染性休克、平滑肌痉挛、微循环障碍及各种神经痛等疾病。80年代以来用于防治ALI，显示出良好的保护作用。以往的研究显示，山莨菪碱对ALI的保护作用可能与其解除肺血管平滑肌痉挛，降低肺动脉压；抑制脂质过氧化反应，保护中性粒细胞(PMN)的细胞膜结构等有关。新近的研究发现，山莨菪碱还具有抗炎作用，可抑制ALI时TNF-α、IL-6、IL-8等细胞因子的释放，但关于其抗炎作用机制的研究才刚刚起步，相关报 一 道甚为少见。本实验采用分子生物学和免疫学方法，观察山莫菩碱对创 伤性急性肺损伤家兔 PAM中 NF－。B活化和下游基因 TNF－a InRNA表 达及支气管肺泡灌洗液旧）中TN－FJ、IL七释放的影响，以探讨 其治疗创伤性ALI的作用机制，为AL的治疗提供实验依据。 实验方法：健康成年家兔 72只，随机分为三组：（）正常对照组【 组），p饱伤性急性肺损伤组门组），门）山莫穹碱治疗组叮组人其 中互组、T组动物于撞击台上撞击后，立即静脉注射大肠杆菌内毒素 （0l；；：民）50vglkg，建立创伤性急性肺损伤模型，C组注射等量生理盐 水。g组动物于模型建立后立即予以山x＃碱 zmwtg静推，随后以 Illlglkglh静脉维持，C组、互组分别予以等量生理盐水静推。各组动物分 别于模型建立后lh、Zh、3h、4h放血处死6只，留取B皿，分离PAM， 分别用凝胶电泳迁移率改变分析法（EMSA）和半定量逆转录一 PCR法 （RTPCR）检测 PAM中 NF八 B的活性变化及 IN’－－A rnRNA的表达水 平，并采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测 BALF上清中 TN’Fl、h＊ 的含量变化。 实验结果：（H组 NF＊ B活性于模型建立后 l叶h内均明显高于 C 组（P＜0．of），在 Zh达到高峰，其相对密度值为 l．59士0．07，是同期 C 组的8倍；T组经山直著碱治疗后，虽然NF－KB活性依然高于C组， 但与 1组相比均有所下降u＜0．of，P＜0．05），Zh时为 l．11士 0．10，较 1 组下降达30．19％，电泳滞后带的深浅变化与之相一致。（2）TN’F－a InRNA 的表达从模型建立后lh即开始上升，3h达到高峰，滞后于NF－K B，其 相对密度值为1．29土0．09，是同期C组的5倍，4h表达较前有所下降， 但仍明显高于C组（P＜0．of＼T组经山直若碱治疗后各时间点TNF刁 M的表达较 1组亦有明显下降（P叨．of，P＜（．05），最大降幅出现在 Zh，达34．48％，TN－F－a cDNA扩增产物条带的深浅变化与之相一致。（） 二 一 1组模型建立N后BALF中TN’F－a、h－8的含量即开始上升，并分别于 3h、4h达到高峰，其含量分别为0．101土0．008nglllil和】．055士0．132ng／Inl， 明显高于C组（P＜0．of），与同期PAM中TN’F a InRNA表达水平的变 化相一致；经山度若碱治疗后，各时间点TN’F－a、ILS含量较豆组均有 明显下降（P＜0．of，P＜0．05），最大降幅分别出现在3h、4h。 结论：（）机体遭受创伤及 LPS刺激后，PAM被激活导致 NF－K B 的活化是PAM大量释放TN’F－Q、n－8等前炎细胞因子的关键环节。（2） 山莫若碱对AL的治疗作用机理可能是通过对PAM核中NF－KB活性的 抑制，从而在基因转录水平抑制NF－KB介导的一系列细胞因子和炎症 介质的表达（TN’F－a、IL－8等），阻断细胞因子和炎症介质的失控性释放 来实现的。