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多次跨膜蛋白EMT-1的结构和功能研究

杨曦  
【摘要】: 七次跨膜的蛋白分子是一个膜表面分子超家族,包括100多个家族成员。它们主要作为一些小分子物质如肽类,激素,细胞因子和多种离子的受体,主要功能是介导细胞外信号传递和调节细胞的生物学功能。如G蛋白偶联受体通过G蛋白介导产生胞内信使(cAMP,cGMP,DG,IP_3)将胞外信号传递到胞内,从而引起生物学效应;内质网上也存在着一些跨膜蛋白,其中一些与蛋白质的合成及运输有关,一些与物质代谢有关,如葡萄糖-6-磷酸酶。跨膜蛋白介导的信号传递往往具有重要的生物学意义,例如Wnts与属于卷曲蛋白家族的七次跨膜蛋白受体结合后,激活胞质dishevelled蛋白发挥其生物学功能激活特定基因转录,在胚胎发育过程中起着非常重要的作用。 本研究工作,利用本室构建的核定位信号筛选系统从小鼠胚胎cDNA文库中克隆到一个新的全长cDNA片段,分析表明在其1802bp 育回军区大学刃士学位论文 的序列中含有一个长1293hp的开放阅读框,编码431个氨基酸。用 BLAST软件在GenBank中没有发现与之同源的核昔酸序列,但在人类 基因组(GenBank登录号为AL139392)包含这段序列,位于6号染色 体pll二21.1。计算机软件分析表明,其编码的蛋白具有多次跨膜样结 构域。我们 将其命名为 EMT-l DdoPlasmic retlculm-locallied Multi《pan Transmembrane proteinq)登录到 GenB咖 登录号为 AF4 90。 通过No,them杂交和MTE膜杂交分析了EMT-l在不同组织中的 表达情况,结果显示EMT-l在人和小鼠的多种组织。肿瘤细胞以及不 同发育时期的小鼠胚胎组织中均有表达,且这种表达随着胚胎发育有升 高的趋势。这种广泛表达的特点提示EMT.l可能具有重要的生物学功 gg。 蛋白质分子的功能与其细胞内定位有密切的关系,因此我们对 EMT.1进行了初步的细胞内定位分析。多种计算机软件分析表明EMT-l 是一个具有多次跨膜结构域的蛋白分子,并且具有内质网定位信号。我 们用绿色荧光蛋白融合于EMT-l全长及其不同截断形式的梭基和氨基 端,瞬时转染COS-7细胞,通过荧光显微镜观察,发现EMT-l编码的 蛋白呈现内质网定位的特点。 为了进一步证实EMT-l 在细胞内的定位及组织分布,拟制备抗 EMT-l抗体,进行免疫组化验证。为此将EMT-l氨基末端基因克隆入 融合表达载体PRSETB中,转化大肠杆菌BL-21,经IPTG诱导,表达HIS6- EMT-l融合蛋白,表达产物分子量约为24Ku。并用Western七h的方法 检测了表达产物。为制备抗EMT.l抗体奠定了基础。


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