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反义寡脱氧核苷酸抑制肝癌细胞VEGF的表达及肝癌细胞中VEGF的自分泌机制

王宏光  
【摘要】: 目前肝细胞癌的各种治疗方法主要是针对癌细胞本身进行的,由于肝癌细胞的遗传性能不稳定,早期发现困难,手术切除率低,且易对化疗和放疗产生治疗耐受,因而寻找有效的治疗途径是提高肝癌生存率的关键。以新生血管为靶点对肿瘤进行生物治疗已成为近几年新的研究热点,与传统治疗手段相比,其具有广谱、放大的抗肿瘤作用,且毒副作用小,不易产生耐药性。此外,随着现代分子生物学技术的发展,反义技术越来越受到人们的重视,尤其是反义寡脱氧核苷酸(ASODN)有望成为率先应用于临床的基因治疗药物,预示着一个肿瘤治疗新时代的到来。 肿瘤血管生成受多种调控因子的调节,其中,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对血管内皮细胞的增殖、水解基膜、迁移和血管构建的调控作用最强,且特异性高。其在多种肿瘤中的过表达促进了肿瘤新生血管的形成,从而维持肿瘤细胞的旺盛代谢,并使肿瘤细胞得以进一步扩散和转移。因此,VEGF及其受体是抗血管生成治疗肿瘤的理想靶位。人们一直认为,VEGF是以旁分泌的方式调节肿瘤的血管形成,即肿瘤细胞分泌的VEGF选择性作用于肿瘤血管内皮细胞上的特异性VEGF受体(Flt-1 第四军医大学博士学位论文 中文扬要 和 KDR),并通过酪氨酸激酶介导的信号转导,调控内皮细胞分化和血管形 成。但近年研究发现,多种肿瘤细胞自身也有VEGF受体的表达,而且针对 VEGF及其受体的干预措施可以改变这些肿瘤细胞的体外增殖活性和其他生 物学特性。这说明肿瘤中很可能存在VEGF的自分泌机制。研究表明,人肝 细胞肝癌中有VEGF的表达,且VEGF的表达与肝癌的生长和转移密切相关。 但对于肝癌中VEGF的自分泌机制尚未见报道。 本研究以多种肝细胞肝癌细胞系为体外模型,以人VEGF 11mNA序列 5’ 翻译起始位点第5Al74位碱基为反义靶点,人工合成ZI聚ASODN,并以其 正义链侣ODM为对照。通过激光共聚焦显微镜观察ASODN在肝癌细胞中的 分布‘惰况,定量分析其作用的浓度及时间特点,并在InRNA、蛋白及蛋白分 泌水平检测ASODN对肝癌细胞VEGF表达的抑制作用。为探讨肝癌细胞中 VEGF的自分泌机制,采用RTFCR、免疫细胞化学染色方法检测了多种肝 细胞肝癌细胞系中VEGF受体的表达。并以MTh法、形态学观察及流式细 胞仪分析等手段研究了ASODN对肝癌细胞体外增殖活性、形态结构、细胞 周期以及膜表面VEGF受体表达的影响。主要实验结果如下: l.VEGF ASODN在 S删CJ72细胞中的浓度随作用时间的延长而逐渐升 高,12h后即能达到较高浓度,48 h达到最高峰,以后则逐渐降低,但作用 可持续 72 h以上;细胞内 ASODN的含量随作用浓度升高而增加,但当达到 一定的作用浓度后,增加的并不明显,5 u mol/L是 ASODN较为理想的作用 浓度。VEGF ASO洲在S删CJ 细胞分布部位主要位于胞浆,胞核也 有少量分布。其中分裂期的细胞对ASODN的摄入能力远大于非分裂期细胞, 且ASODN在分裂期细胞内主要分布在胞核。 2.RT-PCR和免疫细胞化学染色显示,SMMC-772细胞有 VEGF InRNA和 蛋白的表达:VE*F*S*DN可抑制S MMMM*-7721细胞***F的表达。 3.完成牛主动脉内皮细胞田AEC)的体外培养鉴定,并对其生物学特性进行 观测。 — —3 一 第四军医大学博士学位论文 中文拘要 4.SMMC772细胞培养上清能刺激 BAEC的增殖,且随 SMMC-772接种 数目的增加而增大,当细胞数为 1刀 XIO‘时生物活性最高,过高的细胞数反 而抑制 BAEC的增殖。VEGF ASODN能抑制 SMMC-772细胞培养上清对 BAEC增殖的刺激作用,且抑制率与剂量呈线性关系,剂量越大,抑制作用 越强:so*N则基本上没有抑制作用,且*SO*N对SAEC增殖也无直接作 用。 5.体夕培养的SMMC-7721细胞有*-1的弱表达:而HHCC和HCpGZ 细 胞表达KDR。 6.不同浓度 VEGF ASODN对 HHCC细胞增殖有抑制作用,且抑制作用随 ASODN浓度的增高而增强,SODN则对HHCC细胞增殖无明显影响:VEGF ASODN对 SMMCJ72和 L929细胞增殖无明显影响。 7.HHCC细胞经 VEGF ASODN作用后,出现形态学变化。表现为细胞排 列较稀疏,核分裂相减少,细胞异形性降低,细胞表面的微绒毛减少,线粒 体肿胀、空泡形成,染色质边集等。SODN及对照组HHCC细胞形态学无明 显变化:各处理组S MMMMO7刀1细胞形态学无明显变化。 8.流式细胞仪分析 VEGF ASODN作用后细胞周期变化显示,HHCC细胞 S 期比例下降,Q期比例有所上升,且出现一小的凋亡前期峰:而各处理组 SMMC-772细胞周期无明显变化。 9.流式细胞仪检测显示,SMMC-7721细胞膜表面有N-l 的表达,其中 ASODN、SODN及对照组的阳性百分率分别为20%、21.7%和19了%,3组 间无明显差别。HHCC细胞膜表面有KDR的表达,ASODN、SODN及对照 组的阳性百分率分别为19二%、29.8%和31二%,其中ASODN组HHCC细 胞膜表


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