iNOS基因表达调控鼠CFs增殖和胶原合成的作用及其信号转导机制的研究

【摘要】： 心脏由心肌细胞和间质组成。间质胶原构成一个多层次、多方位复杂的三维空间结构，将心肌细胞包裹其中。由于心肌细胞具有收缩性、自律性和传导性，长期以来人们认为心脏有规律、稳定地维持血液循环泵的作用主要由心肌细胞完成，心脏间质胶原只是维持组织结构和参与损伤修复，是一种比较惰性的组织，因此其重要性一直没有得到重视。但是，近年来有关间质的研究发现：(1)相邻的心肌细胞之间通过间质胶原相连接，胶原纤维常插入到收缩蛋白的2带中。这种连接不但维持着各心肌细胞之间固定的排列位置，同时也保证了各心肌细胞在舒张时伸长长度的一致性。心肌细胞间的力传递也可通过这种连接完成，以保证心肌功能的协调性。(2)当间质胶原的含量由正常的3％～5％增至8％～12％时，就会出现心脏舒张期顺应性降低，心室充盈最大速率减慢，左室充盈压升高；当胶原含量增加至20％时，由于心肌细胞被增生的胶原网包围和封闭，不但收缩受限，且力的传递也受阻，此时心脏的收缩功能也发生障碍，射血分数和心搏量降低。(3)间质细胞增生和胶原过度沉积参与了急性心肌梗死后疤痕组织的替代和高血压心脏病左心室肥厚的形成；胶原降解异常是扩张性心肌病、梗死后延展、心室破裂和动脉瘤形成的重要原因。因此间质改建是心脏重构的重要病理基础。CFs增殖和胶原合成、分泌增多是心脏重构的细胞生物学改变，深入研究间质改建与CFs增殖、胶原合成分泌的关系，采取有效手段抑制或促进间质改建，是改 窜曰旱匡大学博士甘位论文 善心脏重构和提高心血管功能的可能途径之一。 本课题研究精氨酸升压素p对心肌成纤维细胞oFS）一氧化氮合 酶／－氧化氮肌SNO）系统活性变化的影响及AVP调控iNOS InRN表 达可能的细胞内信号转导通路，旨在探讨NO与心脏重构的关系，为心脏 重构的病因学提供新认识，亦为心脏重构的治疗提供新的思路和理论依 据。 本研究以培养的新生SD仔鼠CFS为实验模型，＊）采用硝酸还原酶 法测定NO含量，分光光度法测定NOS活性，western6lotting测定NOS 蛋白表达量，RT－PCR测定 oOS InRNA表达量，动态观察基础和 AVP 干预下 CFs的 NOS－NO系统活性变化以及o－l、TN－F－口和 v－IFN对AVP 介导的CFS的NOSNO系统活性变化的影响。m采用MTT法测定细胞 增殖数目，勺－脯氨酸掺人法测定胶原合成功能，动态观察CFS的NOS－NO 系统活性变化对CFS增殖和胶原合成功能的影响。O）采用免疫荧光－共聚 焦显微镜和western七lotting测定CFs的NF1 B的活化状态，观察基础和 AVP干预下N’F－K B活化状态的改变与 WOS InRNA表达的关系，以及AVP 受体、蛋白激酶 CoKC激酶）和细胞外信号调节激酶爬RKS）在 NF＊ B活 化状态改变中的作用。 研究结果表明：O）基础状态下CFS的NO含量、NOS活性、iNOS 蛋白量和iNOS mRNA表达都随培养时间延长而增加。其中36h组的NO 含量（41＊3士5．28 11 mo凡），NOS活性（37l 土4．52U／Inl），iNOS蛋白量（1．47 土0．25）和 iNOS InRNA（＊9士0O2）表达均显著高于 12h组（ZI．of上3 v molfL，15．16上2．77UMi，1．03土0二5，0．21土口刀4）和 6h组（14．ill3．49u molfL，10．26士4．18 U／nl，0．8土0．2，0．l士0＊4）。基础状态下CFs的NO含 量与＊＊S活性正相关（r＝o．837，P＜0刀1）；＊OS活性与o os蛋白量正相关 饲｝83尸＜o．01）；Nos蛋白量与NoslnRNA 表达正相关＊0．7＊， P吻．of＼ （2）l－’M AVP干预下CFS的NO含量、NOS活性、rOS蛋白 量和 iNOS dA表达也随培养时间延长而增加。其中 24h组和 36h组的 NO含量（分别为 65．05．56 uml／L和 62．43．46 u mow），NOS活性（分 别为 70．27士 3．54 U／Inl和 69．33．SU／tnl），iNOS蛋白量份 别为 4．4土 0．4 －4－ 窜回旱巨大学协士学芭论文 一 和4土0．4）和WOS 1llluVA表达（分别为0．69土0．01和0．68土0．09都显著高 于 6h组（33．92士4．05umow，36．门士2．13U／llil，l厂土0．26，0＊ 上0刀5）和 12h组（45＊ 士4．33卜moUL，45．32士1．42U／inl，1．7士0二6，0．24I0刀5），36h 组的NO含量，NOS活性，WOS蛋白量和iNOS II］．－－vA表达虽然都略低 于 24h组，但无统计学意义。10－’M AVP干预下 CFs的 NO含量与 NOS 活性正相关（r＝0．936，P刃刀1）：＊OS活性与1＊OS蛋白量正相关（，O．959， P＜0刀1Xi＊＊S蛋白量与W OSllutNA表达正相关，0．943，P＜0．01X O1小M＊VP干预下各时间点＊Fs的＊O含量，＊OS活性，r＊S蛋白量 和iNOS mRNA表达都显著高于基础状态下。（4不同浓度AVP作用下， CFS的NO含量、NOS活性、iNOS蛋白量和iNOS mRNA表达都随AVP 浓度的增高而增加。其中 10’M AVP组和 10“M AVP组的 NO含量汾别 为 69．05士 5．56 uml／L和 62．86土 6．05 u moW，NOS活性（分另为 71．88 i3．28u毗和66．34土3．SU／InL），rOS蛋白量（分另为4．5土0．45和4．ZI 0．