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幽门螺杆菌免疫芯片诊断系统的研制

李姁君  
【摘要】: 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染世界50%以上的人口,可诱发包括胃炎、胃十二指肠溃疡、胃癌和MLTA淋巴瘤等许多消化道疾病,Hp感染还和许多胃外疾病密切相关。Hp的致病性来源于包括定植力、黏附力和毒性在内的毒力系统,相关研究报道日趋增多和完全,并对cagPAI对CagA的胞内转运及其触发的胃黏膜上皮细胞内信号传递有了新认识。除了Hp毒力系统,感染宿主免疫异质性对感染疾病的转归也十分重要。Hp感染可用抗生素治疗,但是由于耐药性的普遍出现,Hp疫苗的研究已成为当务之急。Hp感染的检测方法目前均为单项指标检测,目的是判明是否感染Hp,蛋白组学分析应该是未来发展的方向。 生物芯片(biological chip)技术可在一次反应中进行多种信息的平行分析,主要包含基因芯片(gene chip)和肽芯片(peptide chip)两大类,是利用生物大分子间具有特异相互识别的特点而发展起来的。随着生物芯片检测自动化程度的不断提高,芯片实验室(lab-on-a-chip)的出现成为可能,是包括芯片处理,信号扫描和数据分析的高技术集成系统。肽芯片是由固定于支持介质上的蛋白或多肽构成的微阵列。近来高密度蛋白点阵在免疫学检测中有了不少应用,所使用的固相支持物有玻片、PVDF 第四军医大学博十学位论文 中文摘要 bof们,inylidenedifluoride)膜、ELISA扳等,可进行高通量的定性和定量 分析。采用的标记技术大多是在生物分子上偶联荧光物质,这样自动化仪 器就可获得芯片片基上反应后的光学信号。胶体金标记技术在检验学中应 用广泛,特点是快速,简便,稳定。 由于Hp基因组测序己完成,大量报道的毒力相关因子为生物芯片在 Hp检测方面的应用提供了基础。 我们在本室已克隆表达 cagA基因 5’端 850hp(命名为 CO)基础上, 对Hp多种国际标准株cagA基因序列比较并设计3对引物,扩增cagA基 因剩余约 2900 hp部分,测序正确后,克隆入 pRSETA His6融合表达载体, 在E CO入 BLZI DE3…L*SS冲进行表达,分别得到了HIS6CI、HIS6CZ和 His6C3三个cagA截短体重组片段。表达产物的相对分子量分别为37000、 28000和 42000。用 HIS6CI和 HIS6CZ表达片段分别免疫新西兰纯种兔, 分别获得了抗 CapA两片段 CI和 CZ的多克隆抗体,抗血清的效价均达 1: 16000,提示所获得的重组蛋白具有较好的免疫原性。 CO采用含50mmol/L L精氨酸pH 8刀的复性液4OC稀释复性,在HPLC 蛋白纯化系统 Q-H},per D阴离子交换柱纯化,用 0二 SM NaCI洗脱杂蛋白, 0.35M N沈洗脱目的蛋白,可得到纯度 90%以上的 CO HIS6-CI、HIS6-CZ 及*拈。*3蛋白变性液在*PLC蛋白纯化系统中亲和层析树脂N厂*TA纯 化,用含0.smol、L一’咪g4罗 50mmol.L一’Trs雪10rnmol.L一’NaCI<pHS.0)的 iK脱液可有效洗脱 HIS。-融合蛋白,得到纯度 90%以上的 HIS6.CI、HIS6.CZ 和 HIS。C土经透析复性后均具有良好活性。用纯化并复性的 CagA抗原片 段包被 ELISA a或点 NC膜,建立相应ELISA和 DIGFA法,检测人血清 中抗CagA抗体,在正常对照及胃癌病人血清中均可检测到相应抗体,而 且阳性率有统计学差异。hstern七lot分析表明,它们均能结合抗Cagh 多克隆抗体。 纯化的CagA截短体抗原CO以剂量依赖的方式刺激培养人外周血单 个核细胞(PBMC)产生TNF-Q;在培养24h时刺激PBMC产主TNF-Q 的水平最高;CO不能刺激 PBMC细胞产生几-8。CI刺激人 PBMC产生 TN卜。的水平明显低于m刺激产生h卜。的水平:但*可明显以剂量 依赖方式刺激人PBMC细胞产生IL8,而且在培养24h时刺激PBMC产 @f研:$Ng HgN。@@ iyX,lfoj、R ttfZ 1· 第四军医大学博士学位论文 中文摘要 生IL8的水平最高。提示纯化的抗原具有生物学活性,而且表达的Hp CagA截短体抗原具有不同的生物学意义。 在本室以往工作及上述研究的基础上和软件信息小组一起完成了Hp 免疫芯片信息化平台的系绞方案。首先在斑点金免疫渗滤试验(DIGFA) 基础上联合以往基因工程技术获得的Hp多种抗原原料建立芯片实验室操 作流程,制备出免疫芯片样品,阳性及阴性对照检测性能良好。采用NC 膜和胶体金标记技术使芯片实验操作快速、简便、稳定。研究开发了芯片 阅读仪,用CCD结合视频采集技术将芯片反应信号转化为计算机可以识别 的数字信号。构建数据库及分布体系还有相应网络系统以实现结果分析、 存储、交换和信息共享。从而最终建立了Hp检测的综合化信息平台。 本室将继续筛选有价值的Hp抗原基因进行基因克隆表达纯化加入免 疫芯片以获得更为完整的Hp检测的


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