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LIM结构域蛋白KyoT的功能和基因剔除小鼠表型的初步分析以及KyoT相关分子的研究

李荣  
【摘要】: Notch是一种细胞膜受体,Notch基因及其编码产物的结构和功能从线虫到人类几乎所有生物中都是保守的,它们在发育中发挥着不可替代的作用。人们把Notch及其配体以及下游信号转导分子和核内应答过程称为Notch信号途径。当Notch受体受到配体的刺激而激活时,它的胞内区在蛋白酶作用下从近膜处裂解,释放出胞内区.释放的胞内区不经其它信号转导分子的作用可直接进核,与DNA结合蛋白RBP-J相互作用并激活下游基因的转录。因此,RBP-J是Notch信号途径中最主要的下游效应物。 RBP-J是果蝇促神经发生基因Su(H)(Suppressor of hairless)在哺乳动物的同源物,它通过其识别序列(C/TGTGGGAA)结合于受调控基因的启动子区,在转录激活因子的驱动下调节细胞分化和个体发育相关基因的表达。RBP-J基因敲除小鼠在胚胎第10.5天死亡,同时伴随一系列异常,包括神经发育过度及体节发育的缺陷,说明RBP-J在哺乳动物胚胎发育中发挥着重要作用。 为进一步探讨RBP-J的功能,日本京都大学的T.Honjo研究组利用酵母双杂交系统从小鼠9.5dpc胚胎和人的Hela细胞cDNA文库中筛选到一个可以与RBP-J 第四军医大学博士学位论文 相互作用的新蛋白 KyOT.KyOT是一种 LIM结构域蛋白,有两种亚型 KyOTI和 KyO TZ,在染色体上由同一基因编码.全长KyOT(KyOTI)蛋白含有四个LM 结构域,不能与RBPJ相互作用;而KyOTh蛋白椭两个LIM结构域,是由KyOTI 的初级转录物经龄性撇产生的.外显子的选择性使用仗撇点后的躯酸读 框发生改变,编码出与RBPJ相互作用的基序.在肌肉母细胞系CZC12内过表达 KyOTh时可阻断转录激活物 NOtch胞内区或 EBNAZ对 RBP*依赖性启动子的转 录激活作用,这种阻断作用呈剂量依赖性,提示 KyOTh可与 NOtCh胞内区或 EBNAZ竞争RBP-J上的结合位点,从而抑制二者的转录激活活性. 为了进一步研究KyoT的功能,我们利用 Northern印迹、兔疫组织化学等方 法对KyOT在体内的分布进行时空定位,并利用本室懈的KyOT基困剔除小鼠 分析其表型,同时采用酵母双杂交筛到 T KyOTh相互作用的 13种分子,并对其 中的一个新分子KBP进行了功能的研究. 结果表明: 1 采用 Northern印迹、RTPCR、Western印蚁现,成年小鼠中,KyoT i要 在肺、肾和睾丸中有特异性表达.在胚胎发育过程中,胚胎第17天其表达 特异增高,但器官分布与咸年小鼠相似.采用免疫组织化学SABC和原位杂 交方法进一步发现,KyOT在小鼠辜丸中有特异性的表达,且特异性分布于 睾丸间质细胞。Northern印迹显示 KyoT在各发育雌小鼠睾丸中均有表达, 橄扫描分析其表达水平在青春期迅速升高,在性成熟期最高.对KyOT基 因剔除小鼠分析发现,剔除小鼠的精子数目较正常小鼠明显减少;HE染色 表明剔除小鼠与正常小鼠的辜九相比,曲精小管管壁薄,管腔内成熟精子数 目少,间质细胞染色深,而且,近曲精小管管腔内大量精子细胞破碎死亡. 上迷结果提示KyOT在辜丸发育和精子成熟过程中账着重要的作用. 2 利用酵母双杂交方法以KyO D为诱饵筛选滁巴结C肌文库,从5 XI 06 个克隆中共获得42个阳性克隆.提取质粒进行酶切鉴定,获得22个非重复 克隆.对此 22个克隆进行序列分析,共获得 13种基因,其中包括已知的 KyOT相互作用蛋白RBPJ和两个未知基因,也包括在哺乳动物睾丸中特异 3 第四军医大学博士学位论文 性表达的蛋白 PIASI,同时还筛到了具有可与 Lm结构鞠互作用的 PDZ domain分子紧密连接蛋白2和两种同属于kG家族的蛋白RINGI 和 polyCOmb 2.以 PIASI、RINGI和 polyCOmb 2为研究对象,同时用 RBPJ作 为阳性对照,首先通过互换载体在酵母中证实KyO D与它们的相互作用.进 而在蛐杆菌中表达纯化了KyO D蛋白,并以此为杭原制备了抗KyO D多 克隆抗体,用 GSTpull down实验进一步在体外蛐杆菌中验证T KyoTh和 它们之间的相互作用. 3 KBP(KyOT Binding POtCin)功能的研究:KBP是我们通过酵母双杂交获得 的与KyO’fZ相互作用的一种新分子。通过RT PCR我们获得了KB P全长的 CDNA,并发现它存在三种不同的剪接体 eP、KBPZ和 eP3,同时通过 计算机比较还获得了它的基因组全长,这三种CDNA和基囵组序列已经在 G_bank上登录于邱。ba出,检索号为AF 493783一o493786。通过人和小 鼠各组织的Northern印蚁现KBP在各种组织中均表达,细胞内定位提示 KBP在整个细胞内均匀定?


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