幽门螺杆菌鞭毛素A多态性和理化性质分析及B细胞表位的鉴定

【摘要】： 背景 幽门螺杆菌 (Helicobacter pylori，Hp) 是澳大利亚医生Marshall和Warren于1982年发现的一种螺旋状的革兰氏阴性杆菌，其发现被视为现代消化疾病研究的一个里程碑。Hp感染在人群中总的感染率超过50％，呈全球分布。西方发达国家的发病率低于发展中国家。目前认为，Hp感染是慢性活动性胃炎的主要致病因子，是消化性溃疡发生及复发的主要因素，Hp感染与萎缩性胃炎、肠上皮化生、胃增生性息肉和胃十二指肠的胃粘膜相关性淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生有关，流行病学调查表明Hp感染与胃腺癌的发生相关，1994年世界卫生组织将其列为Ⅰ类致癌原。根除Hp可促进消化性溃疡的愈合，明显减少十二指肠溃疡的复发，治愈低度恶性MALT淋巴瘤。现今的Hp治疗方案是以抗生素联合应用铋剂或／和质子泵抑制剂(PPI)的“三联”或“四联”疗法，但由于患者的依从性、药物的副作用、费用-效益比、停药后的复发和再感染，特别是Hp耐药菌株的迅速增多等问题的存在使其应用范围受限。现普遍认为Hp疫苗也许是在全球范围内控制Hp感染的最有效的方法。研究已表明宿主持续感染Hp后产生的自然免疫反应与接种疫苗后产生的保护性免疫应答完全不同。尽管疫苗预防和治疗Hp的机理仍未统一，目前倾向于CD4+细胞的免疫调节作用至关重要，Hp疫苗至少在动物实验水平可以清除Hp，达到预防和治疗的效果。美国一项卫生经济模型研究表明若应用疫苗防治人群Hp感染，预计每年将节省5．8亿美元。我国人群Hp感染率高达50-70％，又是胃癌高发国家， 第四军医大学博士学位论文 研究简便、适于人群大范围防治伽感染的疫苗不仅具有理论学术意义，而 且有重要的应用价值。 目前国内外伽疫苗的靶分子多集中在尿素酶B亚单位、Hs的0、Ca吵 及IceA等，佐剂或／和载体包括霍乱毒素（CT）和大肠杆菌不耐热毒素（L）、 CFA（Complete Freund Adjuvant，CFA）／IFA（Incomplete Freund Adjuvant， IFA）、减毒鼠伤寒杆菌和乳酸杆菌等。研究表明上述分子配以不同的佐剂 或／和载体可以在动物实验水平达到全部或部分清除HP的效果。但进一步 临床实验的效果却不能令人满意，相对局限的疫苗靶分子和佐剂对机体不 同程度的毒副作用是制约HP疫苗研究的瓶颈。因而探讨某种新的疫苗分子 和兔疫方式很有必要。合成多肽疫苗是一个较为理想的选择。合成多肽疫 苗的优点在于：l）背景清楚，降低非特异免疫反应带来的污染；2）便于 操作，随着合成肽技术的提高，合成肽链的长度和纯度均比以前有较大的 提高，目前多数公司提供的多肽纯度均高于95％，满足一般作为疫苗的合成 肽的纯度；3）可以方便的调节所需的免疫反应类型，这可能是多肽疫苗最 大的优点；4）可以有效地降低不良反应。 目的 旨在分析HP鞭毛素A的多态性及其理化性质，预测并鉴定鞭毛 素A吓明nA，n“）的8细胞表位，为幽门螺杆菌的疫苗的设计以 及幽门螺杆菌的分子诊断提供一个新的靶点。 方法 由计算机软件设计FlaA中央区的引物，以从西安地区病人分离 的6株Hp的基因组DNA作膜版扩增FlaA中央区的DNA序列。用多种软件 分析己知FlaA全分子氨基酸序列的结构信息，并着重分析中央区氨基酸序 列的结构信息和理化性质，预测B细胞表位。检索GenBank，获得10个HP FlaA中央区的序列，与本实验测序的6个PCR产物序列，分别从DNA水平 和氨基酸水平进行两两比对，分析其多态性。合成T力细胞表位短肽 5 第四军医大学博士学位论文 Pep29mer，Pep29mer含有FlaA 分子预狈的B细胞表位13肽和己证实的源 于流感病毒血凝素前体蛋白轻链HAZ的T细胞表位16肽。以Pep29mer分 别免疫BALB八鼠和BALB八裸鼠，ELISA法和免疫印迹实验检测初次免疫后 第1、3、5及7周动物血清的IgGI、IgGZa、IgA以及胃肠灌洗液的IgA。 结果测定了从中国西安地区分离的6株Hp的门aA中央区的DNA序列。 对FlaA氨基酸序列分析的结果显示：尽管在一级结构上与其它微生物的同 类分于同源性不高，但在二级结构和高级结构上却有类似的结构，分子的 两端序列以a－螺旋为主，形成鞭毛丝聚合体的中心管状结构，中央区以e －片层和无规线圈为主，伸展在鞭毛丝的外部；理化性质分析显示，FlaA主 要的亲水区域位于210～310氨基酸之间，在这一区域有三个亲水峰，分别 位于 210－230，260－280以及 280－300位氨基酸之间。其中第一亲水峰 20 个残基