腺病毒介导的血管内皮生长因子核酶治疗人肺癌的实验研究

【摘要】： 肺癌是呼吸系统常见的恶性肿瘤，其死亡人数和发病率逐年上升，目前该病早期诊断困难，手术、放疗和化疗效果不佳，预后较差。多年来，人们一直在探索肺癌的发病机理和新的治疗方法。业已证明，与许多肿瘤一样，肺癌的生长和转移有赖于肿瘤组织新生血管的形成，而血管内皮生长因子(VEGF)是促进肿瘤血管生长最主要而直接的因子。因而通过各种方法抑制肿瘤血管生长就有可能抑制肿瘤的生长和转移。核酶(Rz)可序列特异性地结合并切割叫RNA，通过人工设计合成核酶即可达到破坏目的基因表达的作用，因此在基因治疗领域备受重视。近年来，抗肿瘤血管生长和利用核酶高特异性阻断失控基因，或有害基因治疗肿瘤的尝试极为活跃。但由于核酶基因定向导入靶器官的问题未能得到很好的解决，利用核酶阻断VEGF表达治疗肿瘤不可避免地会抑制其它组织器官VEGF的正常表达。腺病毒是目前基因治疗中应用最为广泛的一种病毒载体，具有宿主细胞广泛，既可以感染分裂期细胞，又可以感染非分裂期细胞和容易制备高滴度病毒等多种优点，且对呼吸道上皮具有天然的亲嗜性和器官特异性，因此特别适合于肺癌的基因治疗。 本研究设计合成针对VEGF_(165)，212位点的锤头状核酶及其突变体，构建 第四军医大学博土学位论文 其腺病毒真核表达载体，并感染人肺腺癌细胞A549，观察核酶对肿瘤细胞生 物学特性和VEGF；。。表达的影响及其对肿瘤生长的抑制作用。主要方法和结 果如下： 1．根据VEGF；。。基因CDNA序列，利用计算机核酶设计软件设计针对 VEGF；。s212位点的锤头状核酶RzZ12及其突变核酶InRz212，通过基困重组 构建含有 5’，3’顺式核酶的 RzZIZ和 mRzZIZ原核表达载体 PGEMffeZIZ和 p＊＊InRz 212，酶切和测序证实核酶和突变核酶基困序列正确。 2．核酶和突变核酶体外转录后进行体外切割反应，6％PAGE胶电泳、放 射自显影结果表明，核酶切割VEGF；。。rnRNA的效率为 90．7％，而突变核酶 没有切割作用。 3．将带有y，y）烦式核酶的k二12和InRz 212定向克隆入腺病毒穿梭质 粒 pAdCMV，构建腺病毒目的基因转移质粒 pAdCMVRzZIZ和 pAdCW 1lliu212，酶切鉴定构建正确。目的基固转移质粒和腺病毒基困组质粒 pJM 共转染 293细胞，通过 RNA斑点杂交、PCR扩增表明产生了带有核酶和突 变核酶的重组腺病毒，病毒滴度为8．Zxlo’V。 4．用重组腺病毒感染人肺腺癌 A549细胞，RNA斑点杂交证实核酶基因 转染成功，激先共聚焦分析显示，与对照组、空载体组和突变核酶组相比， 核酶组细胞VE＊几。。的表达减少90％（尸＜0刀1），流式细胞仪测定肿瘤细胞 周期无改变；肿瘤细胞的生长速率亦无改变。 5．裸鼠移植瘤实验表明，与其它三组相比；核酶组致瘤性显著降低（SW 时核酶组、突变核酶组、空载体组和对熙组的肿瘤体积分别为560土 112．snun’、7540 t 1035mm’、7610 t 950nim’和 7780 t 1050nun‘），表现为裸 鼠皮下移植瘤形咸较晚，生长速率较慢，肿瘤体积小，激光共聚焦分析显示 肿瘤组织VEGF；。。含量显著下降，CD34免疫组化结果提示肿瘤血管形咸明显 减少（尸＜o．01）。 上述结果表明，利用腺病毒感染细胞谱广和病毒滴度高的优点，可在靶 组织产生高丰度的目的基困，联合核酶对靶 rnRNA的高度特异性切割作用， 能够高效抑制VEGF的表达，有效抑制肿瘤和新生血管的形咸。特别是利用 3 第四军医大学博士学位论文 一 腺病毒对呼吸道上皮的亲嗜性，可以克服肺癌基困治疗中的组织和器官特异 性的难题，为肺癌的基困治疗提供新途径。