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人牙本质涎蛋白的基因克隆、表达和功能研究

张莹  
【摘要】: 牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)属于牙本质非胶原蛋白,占牙本质非胶原蛋白的5%~8%,因与骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)相似而得名。DSP富含谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)和甘氨酸(Gly),由366个氨基酸组成,分子量约为53 000,含30%的碳水化合物和10%的涎酸,有6个潜在的糖基化位点和13个潜在的磷酸化位点。DSP的功能尚不清楚,考虑到DSP在成牙本质细胞中有阳性表达,并在前成釉细胞中有一过性表达,推测DSP可作为成牙本质细胞和相关细胞的标记物,并可能在上皮和间充质之间充当信号分子,参与成牙本质细胞分化。 一、人牙本质涎蛋白的基因克隆、表达、多抗制备和组织表达研究 克隆hDSP成熟肽编码区基因片段并进行原核表达,用异硫氰酸胍一步法从人牙乳头组织中抽提总RNA,再用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头cDNA,然后用RT-PCR法,从cDNA中扩增出hDSP基因片段(约600bp),将所得基因片段插入pBluescript质粒载体,转化到大肠杆菌XL1-Blue后,挑选阳性克隆,提取重组质粒DNA,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆;再将hDSP基因重组入表达载体pGEX-3X中构建表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达。结果酶切图谱和序列分析与文献报道一致,并且hDSP蛋白(约200个氨基酸)在大肠杆菌中得到了高效表达。用原核表达并经过纯化 第囚旱巨大学傅士学位论文 的人牙本质涎蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗血清,抗血清效价可达1: 100 000。用 Western blot法检测不同组织的表达情况,结果显示 hDSP在人牙 胚中有表达,分子量约为60 000左右,而其它软组织(包括牙龈、肝、肾。 脾等)则无表达,其分子量大小与天然牙本质中DSP的分子量接近。 二、人牙本质涎蛋白全长基因表达载体的构建和莫核细胞转染 用原核系统表达目的蛋白具有产量高、成本低、操作简单等特点,但是原 核系统表达的目的蛋白不具备折叠、糖基化等特点,所以用原核系统表达的目 的蛋白常常不具备天然蛋白的功能。由于hDSP是高度糖基化的糖蛋白,所以, 最好选择真核表达系统。本研究将hDSP全长基因克隆入真核表达载体 pCDNA3中,构建pCDNA3-hDSP重组质粒。酶切鉴定和测序正确后,将 pcDNA3-hDSP真核表达质粒转染COSJ细胞,Western Blot和免疫组化均证 明hDSP在COS刁细胞中得到了较高表达,为其功能研究提供了保障。 三、人牙本质涎蛋白的功能研究 首先,通过免疫组化方法观察了hDSP在人牙胚不同发育阶段的表达情 况。显示hDSP在蕾状期、帽状期成釉器上皮、钟状早期内釉上皮有弱表达, 正在分泌基质的成牙本质细胞、牙本质小管有强阳性表达,而在钟状晚期, hDSP主要在牙本质小管中表达,成牙本质细胞转为弱阳性表达。前成釉细胞、 成釉细胞有一过性表达,而前期牙本质始终无阳性表达,牙胚周围牙槽骨、软 骨和口腔软组织无阳性表达,提示hDSP是牙齿特异性的蛋白,它只在成牙组 织中有表达。另外hDSP在前成釉细胞和成釉细胞中的一过性表达,提示hDSP 不仅参与了牙本质的形成,而且还可能参与了上皮和间质之间的信号传递。再 者前期牙本质阴性表达,表明hDSP蛋白直接通过成牙本质细胞突起穿过前期 牙本质分泌至矿化前沿,参与牙本质的形成。 其次,观察了hDSP对体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖和碱性磷酸酶 活性的影响。选择第5代人牙乳头间充质细胞,通过MTT比色法观察细胞增 殖情况,发现hD盯能明显抑制培养的人牙乳头间充质细胞增殖(P<0刀1);通 4 第q罩巨大学俗士学位论X 过检测细胞内和细胞外碱性磷酸酶活性,发现hDSP能明显促进培养的人牙乳 头间充质细胞碱性磷酸酶的分泌(P<o.01),提示hD SP在人牙乳头间充质细 胞的分化和矿化过程中可能起重要的调节作用。 最后,通过hDSP对狗牙直接盖髓观察hDSP对牙髓损伤修复的影响。选 择体重 10 kg左右、年龄 6~12月的健康杂种狗 3只,选用尖牙、磨牙为实验 牙,共30个。分实验和对照两组:实验组:hDSP表达上清浓缩液加胶原膜, 18个牙;对照组:空白载体表达上清浓缩液加胶原膜和 PBS加胶原膜,各 6 个牙。胶原膜作为载体与实验组、对照组的液体复合,4”C过夜。 结果:hDSP盖髓术后2周,对照组和实验组牙髓组织炎性细胞少见,成 纤维细胞增生明显,实验组和对照组均无牙本质桥形成。随着盖髓时间的延长


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