基质金属蛋白酶在局灶性缺血及再灌注后的表达、调节及意义

【摘要】： 金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一组锌依赖的蛋白水解酶，具有降解多种细胞外基质成分，如胶原、层粘素、明胶、弹性硬蛋白、粘连蛋白及蛋白多糖等功能。通常情况下，MMPs受多层次的调控并以酶原的形式存在，激活过程受丝氨酸蛋白酶或纤维蛋白酶的介导，也可以自主催化激活，此外还受其特异性组织抑制剂(TIMPs)的调节。近年的研究表明，MMPs参与了缺血后脑损伤的病理过程。临床上已有报道MMP-2及MMP-9的活性在脑中风发作后明显升高。动物实验也显示局部脑缺血后MMP-9在早期就被激活，抑制MMP-9的活性可以减小脑梗塞面积。所有这些表明，MMP-9参与了缺血后脑损伤的病理过程；同时提示MMP-9可能是一个潜在的治疗靶点。为了探讨MMPs在缺血性脑损伤过程中的意义，我们从下列四方面进行了初步研究：1．利用显微手术技术和多功能生理监测手段建立稳定的小鼠局灶性线栓脑缺血及再灌注模型；2．在小鼠局灶性永久脑缺血模型上检测MMPs的表达，并检测 虏 口 旱 匡 大 纱 博 士 学 戍 论 文 一 MMPS抑制剂KB－R7785对永久性脑缺血的保护作用；3．利用RT－PCR、 NOrthern七＊ 和酶谱分析技术检测 MMPs及其组织型抑制剂（TIMP）在 局灶性脑缺血再灌注后的表达，同时检测分裂原激活蛋白激酶抑制剂 U－of 26对 MMPs及其组织型抑制剂（TIMP）在脑缺血再灌注后表达的影 响：4．分别或同时利用EVallS bltts外渗法和TTC染色法检测U－0126和 KB－R7785对缺血再灌注后脑梗塞灶和脑水肿形成的影响。本实验研究将 进一步阐明MMPS在缺血性脑损伤中的致病机制，为针对MMPS的脑保 护药物的开发提供一定的理论依据。 H 小鼠局灶性线栓脑缺血及再灌注模型的建立。本实验利用显微手术 技术和多功能生理监测手段，显微镜下游离人侧颈总、颈外及颈内动脉， 用5－0丝线分别结扎颈总动脉近端及颈外动脉；经颈总动脉插入8－0尼龙 纤维线段（门mm），将其头端送至左侧大脑中动脉起始部。通过激光多谱 勒流量仪监测人脑中动脉血流量，当其突然降至栓塞前血流量的25％以 下，即标志着闭塞大脑中动脉（MCAO）成功；而暂时性脑缺血及再灌注模 型则经颈外动脉将8＊0尼龙纤维线段头端送至左侧大脑中动脉起始部，Zh 后抽出线段，恢复血供，其再灌注率达到栓塞前血流量的95％以上，即 标志着再灌注成功。术后24h的脑切片经hC染色计算梗塞灶的大小。 通过反复实践和摸索，我们认为如下几方面是决定模型可靠性和稳定性的 关键：1．线段的制备和选择。首先线段的制备要求硅胶树脂涂层要均匀 一致。头端要圆钝，避免形成锐尖或弯钩，以防止穿破血管的危险；另外， 山于动物血管的个体差异与动物的体重呈正相关，因此在模型制作中一方 面要求个体体重要尽量一致；另一方面还需要根据体重的大小选择不同粗 细的线段。2．动物种系的选择。不同种系的小鼠由于颅底WillS环发育 的差异，使得不同模型的要求具有相对的种系选择性。在本实验中我们分 别用不同种系的小鼠（ICR和 DDY）进厅了模型的对比和筛选，发现在 －4－ 第 囚 旱 医 大 学 浴 士 学 位 论 文 一 永久性脑缺血模型的制作中，ICR小鼠的成功率和稳定性均高于DDY小 鼠；而后者在暂时性脑缺血及再灌注模型制作中又优于前者。这为我们下 一步实验的动物种系选择提供了依据。3．局部脑血流（dBF）及其他基础 生理参数的实时监测。山于局部脑血流（rCB）及体温、平均动脉压、血糖 等参数都会影响脑缺血及再灌注后的损伤结果，因此，在模型制备过程中 对上述参数的实时监测和调控为个体间和组间的损伤结果评估提供了客 观可比性依拢。总之，我们的实验结果表明，借助于显微技术和多功能生 理监测手段建立起的小鼠局部线栓脑缺血模型重复性好、可比性强，操作 简便易行，避免厂颅，线段可经颈外动脉插入且很容易抽出，附加创伤小， 不仅可以以低廉成本进行大宗实验，而且几乎可以观察到其他在大型动物 模型上所能观测的指标，完全能够满足我们下一步的实验要求。 口 利用小鼠局部永久性线栓脑缺血模型，观察了MMPs抑制剂 KB－R7785对局部永久性脑缺血后脑梗塞形成的影响。通过观察不同时 间、剂量KB－R7785对24 h后脑梗塞灶体积的影响及应用酶谱印迹技术