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胎鼠表皮干细胞的体外分离培养及其在表皮和毛囊再生中的作用

韩军涛  
【摘要】: 目的 初步探讨鼠胚胎期表皮干细胞及毛囊乳头层细胞的体外分离培养方法;通过对表皮干细胞及毛囊乳头层细胞的复合立体培养,构建新型鼠皮肤等价物并建立其动物移植模型,观察并探讨移植后表皮干细胞在表皮及毛囊再生中的作用;初步探讨表皮干细胞的基因可操作性及转染外源性基因在皮肤干细胞示踪研究中的可行性。 方法 利用显微外科技术分离15~18天龄胎鼠的单根胡须毛囊并对毛乳头进行组织培养,获取毛囊乳头层细胞;剥取胎鼠全层皮肤,分别通过dispase酶及胰蛋白酶消化法获取胎鼠表皮细胞悬液,利用表皮干细胞对Ⅳ型胶原的快速贴附特性,通过预铺鼠Ⅳ型胶原的培养板实现其初步体外分离培养;以同源角质形成细胞为对照,对表皮干细胞的克隆形成能力及细胞周期进行相关检测,分别通过细胞免疫化学及荧光抗体技术检测细胞的β1-整合素及角质蛋白-15表达水平;将毛囊乳头层细胞接种在纤维蛋白胶中,并与表皮干细胞膜片复合培养从而形成鼠皮肤等价物,在移植覆盖裸鼠全层创面后8~10周通过大体标本及病理切片观察移植后皮肤及毛囊结构的再生;利用脂质体转染法将真核表达载体pIRES2-EGFP转入表皮干细胞中,通过G418筛选阳性克隆并观察转染后细胞内绿色荧光蛋白的表达强度及持续时间。 结果 在毛乳头组织培养后的1~3天内即可获得原代毛囊乳头层细胞,细胞在传代培养中呈现出其特有的簇性生长特征;通过Ⅳ型胶原快速贴附法可实现 第四军医大学博士学位论文 对胎鼠表皮于细胞的初步分离培养;表皮于细胞在原代及传代过程中均有很强 的克隆形成能力并可形成较大克隆,而角质形成细胞虽具有一定的克隆形成能 力但其克隆均相对较小;表皮干细胞及角质形成细胞的克隆形成率分别为 15.3a.3%和6石h.1%,两者比较有显著性差异O功刀5);细胞周期的检测结果 分别为,表皮干细胞*期细胞数为94.9%,S期细胞数为3.5%,角质形成细 胞GI期细胞数为74.l%,S期细胞数为17.5%,说明表皮干细胞的分裂增殖 速度明显慢于角质形成细胞:表皮干细胞的pl.整合素及角质蛋白.15的免疫 染色结果显示大部分细胞呈强阳性表达,而角质形成细胞则多为阴性或弱阳 性;新型皮肤等价物的裸鼠创面移植模型结果显示,表皮干细胞在毛囊乳头层 细胞存在时可形成新的较完整的表皮及毛囊结构,而在真皮成纤维细胞存在时 只能形成较完整的表皮组织;脂质体可成功将真核表达载体pIRESZ*GFP转 入表皮干细胞中,经G4筛选获得的阳性克隆细胞在早期有较强的绿色荧光 蛋白表达,但在传代过程中表达量逐渐降低,不能持续稳定表达。 结论通过IV胶原快速贴附法可初步实现鼠胚胎期表皮干细胞的体外分离及 传代培养;胎鼠毛囊乳头层细胞可通过培养组织培养获得且在立体培养系统中 生长稳定;通过动物模型证实表皮于细胞在移植后可形成新的较完整的表皮组 织,且在毛囊乳头层细胞的诱导下可形成新的毛囊结构,说明表皮干细胞可分 化形成新生表皮及毛囊中所有类型的上皮细胞,而毛囊乳头层细胞则是新生真 皮细胞类型的主要来源,这为在此基础上构建新型皮肤组织替代物提供了参考 资料;以表皮干细胞为靶细胞进行基因转染及相关研究是可行的,但其稳定性 尚待进一步探讨,真核表达载体pIRESZEGFP不能用于表皮干细胞的示踪性 研究。


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