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小鼠腭裂相关基因的克隆、筛选及功能的研究

李鑫  
【摘要】: 腭裂是口腔也是全身较常见的先天性发育畸形,在亚洲、尤其是中国更是高发区。1996~2000年全国出生先天性畸形缺陷检测结果显示,先天性唇腭的发生率排在首位。对该畸形的治疗手段目前仅限于患者出生后的手术修补,术后仍然不能完全恢复患者语音功能,并影响以后牙齿萌出、排列和患者的心理健康。先天性腭裂属于多基因遗传性疾病,有许多基因协同作用参与疾病的发生。如能明确腭裂的发生机制,制定相应预防及早期诊断措施,将会有效预防腭裂畸形的发生。因此,有众多学者长期致力于腭裂畸形发生,机制的研究,试图揭示人类腭裂发生的秘密。本研究利用分子生物学的消减杂交技术,直接提取对照组和腭裂组小鼠发育形成期腭突组织中的mRNA,对两者之间差异表达的基因进行克隆和筛选,获得一系列与腭裂发生相关的基因,并初步探讨了相关基因的染色体定位、结构及作用。研究主要分为以下3部分内容 一.RA诱导的MSX-1基因在腭突间充质细胞中表达变化的研究 取妊娠12天CS7BL/6N系孕鼠的腭突组织,组织块培养法对腭突间充质细胞进行原代培养,免疫组化法进行波形丝蛋白、角蛋白、第八因子、NSE、S-100及HNK-1的单抗染色,进行细胞来源鉴定。培养5代后用于实验,分为实验组和空白对照组,实验组加入1×10~(-8)mol/L浓度的ATRA,原位杂交法检测MSX1基因在两组细胞中的表达变化。结果显示:对照组细胞处于增殖状态,MSX1基因表达弱阳性。而RA处理组的细胞出现增殖抑 第四军医大学博士学位论文 制,细胞中 MS川基因表达呈较明显的阳性。原位杂交结果提示 MSX基因 是RA发挥作用的靶基因,它的异常表达干扰了胯突细胞的正常增殖, 二 小鼠胯裂相关基困的克隆及基因表达的意义 在建立的C57BL/6N近交系,J、鼠胯裂模型的基础上,提取妊娠12天69实 验组和对照组胚鼠胯突的1llRNA,反转录合成CDNA,利用基于昨R的改良 消J戍杂交技术首先建立小鼠聘裂差异表达CDNA文库。筛选文库,选取500hp 。人上的片段回收,反向卢、杂交鉴定除去假阳性和假阴性克隆。利用Ge;旧a* 数据库对测得的基固序列进行核酸序列的同源性比较分析。结果:获得小鼠 )J母乳形成中表达差异的4个新基因,经N0rtherl。blot 鉴定1号新基因为 i亥基因 CDNA全长,定位于,J、鼠 9号染色体,共有碱基 850hp;编码 132个 各基酸,经国际基因命名委员会批准将获得的新基因命名为MCPR.1(1ilo;Ise cleftoalate related selle)。止匕夕;实验中还克隆三与细胞增殖、生长有关的核 糖体基因士。L27、L23等和小鼠F。U基因。 核糖体蛋白在原核和真核细胞生物中广泛存在,近年来的研究发现它们 与细胞凋亡有密切的关系,应用消减杂交技术克隆凋亡相关基因时,常常能 克隆到核樵体基因。小鼠* 基因位于小鼠的第19号染色体长臂,具有管 家基因的特征,广泛表达于胚胎发育期*、鼠各内脏器官,但尚未见到在胯突 未达的报道,它对细胞的生长具有抑制作用。本研究中核糖体、f。U基因的 表达可能参与了聘突细胞的增殖周期相。制和凋亡过程。 三.MCPR-1、rail基因在小鼠胯突及各脏器组织中的表达变化 原位杂交技术和阿一PCR检测了MCPR-]、厄U基因在实验组、对照组胚 胎小鼠胯突组织,出生 1天和成年鼠各脏器中的表达情况。结果显示:MCPR*1 基因仅在实验组跨突组织中表达;与对照组小鼠相比 fan基因在实验组中的 表达水平明显增高。叮一阿R结果显示:论叫一1基因在出生后小鼠胯突、。。 )A、肝脏、脑等组织中均无表达;fan基因在出生1天及成年小鼠小鼠。。脏、 肝脏、脑等组织中都有表达。本实验结果提示:MCPR-1基因是在*诱导之 下仅在胚胎跨突组织中表达的基困。而fail基因作为一种管家基因,在实验 业小鼠胯突中的异常高表达,可能在聘突细胞增殖过程中起负向调控作用, 7 第四军医大学博士学位论文 间接而参与了聘裂的发生。


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