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抗肿瘤中药成分的筛选及作用机理研究

韩月恒  
【摘要】: 自然界中植物种类多种多样,可用于肿瘤治疗的植物药也是数量繁多,如果能将其中起主要作用的有效成分分离出来,研究其理化性质及作用机理,对于抗肿瘤新药的研制开发将具有非常重要的意义。 为此,我们选取几种肿瘤细胞系,以培养细胞为实验模型,用MTT试验、软琼脂试验等方法,在细胞水平检测了多种中药提取物或单体的体外抗癌作用,筛选出能够以较低浓度(微克/毫升水平)抑制肿瘤细胞生长或增殖的药物。在此基础上,以荷瘤小鼠为实验模型,在动物水平检测了姜黄素和水飞蓟素两种单体的在体抑癌作用。筛选的25种中药单体及粗提产物中,发现可能有抑制肿瘤作用的(镜下观察有明显细胞形态改变的,如细胞皱缩,破碎,漂浮等)有12种。其中,几种纯度较高的单体抑制浓度能达到微克级水平,与它们在动物体内血浆和组织分布的浓度水平比较接近。动物实验表明,姜黄素和水飞蓟素都没有急性毒副作用,水飞蓟素的作用符合体内抑瘤试验的有效标准,与未处理组及橄榄油注射组有显著性差异;姜黄素处理组虽有肿瘤平均重量的减少,但不具有显著性差异,且肿瘤重量的变异范围较大。 根据第一部分实验的筛选结果,我们重点选择姜黄素和水飞蓟素,深入研究了这两种中药单体的抗肿瘤作用机理。其中,姜黄素对各种肿瘤细胞都 第口N回J一丰协士吵应论义 第 5页 有极强的抑制作用,因此,考虑用姜黄素作用于耐药肿瘤细胞,观察其作用 效果,包括药物对耐药胃癌细胞SGC7901/VCR的抑制作用,与其它常规化 疗药物的协同性,能否诱导凋亡及相关分子机制等。我们首先通过MTh试 验确认,多药耐药的人胃腺癌细胞系SGC7901/VCR对姜黄素并没有耐受现 象。进而,检测了姜黄素与常规化疗药物的协同作用。我们的研究表明亚剂 量姜黄素与三种常规化疗药物联合应用,均有协同作用,包括姜黄素与1倍 血药高峰浓度的阿霉素,与0.l、l、10倍血药高峰浓度的5.氟尿嗜唆,及与 1倍血药高峰浓度的长春新碱。也就是说,低剂量的姜黄素可以在一定程度 上逆转SGC79001/VCR细胞的耐药表型。通过对用药后DNAladder的检测, 以及用 Western blot检测 PARP裂解,发现姜黄素可诱导 SGC7901/VCR细胞 发生凋亡,且其作用既是剂量依赖的也是时间依赖的。先前的研究表明MAPK 家族成员参与了由特定药物如阿霉素、长春新碱等选择的肿瘤细胞多药耐药 的进展。我们采用 Western blot方法,应用针对 MAPK家族成员 JNK、ERK、 p3 8磷酸化形式及非磷酸化形式的特异性抗体,检测了姜黄素作用后以上激 酶的表达水平及活化程度的改变。在不同浓度药物u,10,20,40 p M) 作用24hr后,这几种激酶的表达水平都没有明显的改变,而它们磷酸化的程 度与加人DMSO的阴性对照组相比则有显著的改变。其中JNK和ERK的磷 酸化受到明显的抑制,而p38的磷酸化水平有一定的增加。激酶的磷酸化程 度体现了其活化水平,因此,我们认为姜黄素的作用抑制了JN’K和ERK的 活性,而在一定程度上提高了 p3 8的活性。而姜黄素对 MAJ,K家族成员不同 的调节作用与细胞的存活状态及凋亡程度可能具有一定的相关性。这也为我 们了解MAPKS的表达水平活化程度与SGC7901/VCR细胞的存活状态之间的 相关提供了线索。 在第一部分实验中,我们还发现水飞蓟素对几株恶性程度有明显差异的 乳腺癌细胞有不同的抑制作用,并且对恶性程度高的抑制作用较强,对恶性 oe,arrn’e’t’ ofaioca肋血QMd,’otetulara切b区入’.’.,ti 窜曰旱回一沁剧u眸s@卜江们n欠 第6页 程度低的较弱。这种现象使我们对水飞蓟素的作用机理产生了很大的兴趣。 因此,我们首先用MTh试验检测了水飞蓟素对乳腺癌细胞的作用,并多次 验证了第一部分的观察。其次,用水飞蓟素作用于体外培养的人外周血淋巴 细胞以及永生化的人胃粘膜上皮细胞GES-1,以观察水飞蓟素对正常细胞或 低恶性程度的永生化细胞的杀伤作用。实验结果表明,水飞蓟素对淋巴细胞 和永生化GES八细胞的抑制作用最弱,对SK-BR-3细胞的抑制作用较正常细 胞强,但明显弱于另外二种乳腺癌细胞,MCF7和 MDA-MB-23。这提示, 水飞蓟素对于恶性程度高的细胞的抑制作用强于恶性程度低的细胞。进而, 我们用流式细胞仪分析了水飞蓟素对几种乳腺癌细胞细胞周期的影响,发现 随着药物作用时间的延长,与阴性对照相比,SK七R3细胞的 GI期细胞比 例增多,出现了GI期阻滞,而另外两种细胞则有GZ期细胞比例增多的表现, 即GZ期阻滞,此外,MCF-7细胞还出现了较典型的凋亡峰。我们推测水飞 蓟素对几种恶性程度不同的乳腺癌细胞的选择性作用可能于它对这几种细胞 的细胞周期的不同的调控有关。并且,对水飞蓟素作用靶分子的进一步研究 有助于揭示造成几种乳腺癌细胞恶性程度差异分子基础。 综上所述,我们首先通过细胞水平的药物敏感性分析和动物水平的在体 试验,从25种中药单体或粗提产物种筛选出十余种可能具有抗肿瘤作用的成 分,并深


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