血管内皮生长因子变异体基因的构建、表达及表达产物体内诱导自身抗体产生的研究

【摘要】： 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 最早是由体外培养的肿瘤细胞无血清培养基中分离出来的，最初发现它能提高血管的通透性，命名为血管通透性因子(vascular 穷日早巨大学棋士学位征文 permeability factor，pF）。进一步发现，VPP能选择性地促进血 管内皮细胞（。ndothelialcell，EC）分裂，遂命名为血管内皮生长 因子。VEGF是一个大的家族，包括 VEGFtt，VEGF－B，VEGF－C，VEGF－D－D 和胎盘生长因子（placenta rowth factor，PIGF）等，通常所说的 VEGF即指VEGF－A。VEGF的基因位于染色体6PZI．3，全长28kb，编 码VEGF的基因长 14kb，由 8个外显子和 7个内含子组成，VEGF的 CDNA分析提示VEGF蛋白编码存在多样性，8个外显子进行不同的拼 剪产生不同的VEGF表现形式。目前，至少存在5种不同的VEGF分子： VEGF；。；，VEGF；4。，VEGF；。，VEGF；ss和VEGFZ。VEGF；。。由外显子l～5、7 和8编码，可分泌至细胞外间质，但也有相当一部分蛋白质结合于细 胞表面或细胞外基质，在体内丰度最高，目前应用也最广泛。VEGF 由两个亚基形成的同源糖蛋白H聚体，分子量约为45kD．在每个单 体中，N端起始部为由16－24位氨基酸形成的一个口螺旋，中间由4 股 p片层结构组成，包括 pl（27－34）、i 3（51－58）、p 5（73－83） 和 p 6（89－99），其中一端形成脱氨酸结，以一个亚基的第 51位半脱 氨酸和另一个亚基的第60位半脱氨酸组成2条二硫键，连接而形成二 聚体。在还原条件下，二聚体分开形成单体，并丧失所有的生物活性。 VEGF有两个主要的高亲和力受体：Fit－1和KDR，尽管＊l的亲 和力高于＊R，但几乎所有的促巩活性都是由mR实现的。VEGF是 目前公认的高选择性的EC有丝分裂原，研究表明，VEGF的表达与组 织中的微血管密度密切相关，在体外VEGF可促进EC增殖、移行，体 内可诱导血管生成。业已证实，在几乎所有肿瘤组织中，都有VEGF 的高表达。VEGF的表达与肿瘤的恶性程度、进展、转移及预后呈显 著相关性。因此，以血管生成的各个环节为靶点，通过血管生成抑制 7 Bio’emnowm， Ct FMMU 京日早巨大学低士学位征文 剂来控制肿瘤生长和转移，成为肿瘤防治的一个重要途径。由于血管 生成抑制剂直接作用于增殖的EC，因此抗瘤谱广，也不会造成骨髓 抑制、胃肠道反应或脱发等传统化疗药物造成的毒副反应。而且，EC 作为新生血管的前体，其遗传性状稳定，很少发生变异，不易产生耐 药性。大量实验已经证实，在裸鼠肿瘤模型中，应用VEGF抗体阻断 其促血管生成作用后，可以显著抑制原发肿瘤的生长和转移。但由于 外源性抗体成本较高，不适宜大规模生产，而且抗体本身的免疫原性 也会导致自体排斥反应，影响远期疗效，限制了其进一步应用。 基于这些研究，我们设计了人VEGF；6；的一种变异体，在VEGF；。 的核基末端引入了辅助性T淋巴细胞的抗原表位序列，同时，为了使 此变异体失去促血管生成的活性，我们参考VEGF；。与受体结合的位 点，去掉了 VEGF；。s氨基端的 16位氨基酸。我们将此变异体基因定 向克隆入表达载体 PRSET B中，转化大肠杆菌 BLZI（DE3）菌株，得 到了高效表达。在此基础上，对BALB／C小鼠进行了主动免疫，并接 种腹水瘤细胞 SI 80，建立肿瘤模型，抑瘤实验表明：VEGF；。；变异体可 以诱导产生高浓度自身抗体，抑瘤率达到64．7％，与对照组相比，有 明显差异（P＜0．of）。 我们的研究表明，构建的VEGF；。；变异体，失去了促血管生成的活 性，但体内可以诱导产生自身抗体，抑制肿瘤的生长，为肿瘤的抗血 管生成治疗提供了新的手段。