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人骨保护素的表达及生物活性研究

刘继中  
【摘要】: 骨保护素(osteoprotegerin,OPG)是1997年发现的分泌型糖蛋白,能抑制破骨细胞分化、抑制成熟破骨细胞的活性并诱导其凋亡。OPG属于TNF受体(TNFR)超家族,含7个结构域(D1~D7),有21个氨基酸的信号肽和380个氨基酸的成熟肽,N-端D1~D4区富含半胱氨酸,是发挥生理功能所必需,D1~D4区(1至185位的半胱氨酸)编码的蛋白即具有抑制破骨细胞分化成熟的功能。C-端的D5、D6区为两个紧密相连的死亡域,与Fas的跨膜区融合表达后可直接介导细胞毒作用。D7区内有肝素结合位点,与二聚体形成有关。OPG单体和二聚体具有相似的热、酸稳定性和生理功能。 成骨细胞、骨髓基质细胞及活化的T淋巴细胞表达RANKL,与破骨细胞表面的RANK结合后促使破骨细胞分化增殖。OPG是RANKL的假性受体,与RANKL有高度的亲和力,可竞争性抑制RANKL与RANK之间的结合。体内调节骨代谢的激素或细胞因子,如TNF-α、TGF-β、1,25(OH)_2D_3、雌激素、骨形态发生蛋白-2以及PTH、PGE_2、糖皮质激素等均通过调节OPG/RANKL的表达而发挥作用。由于异常增强的破骨细胞生成和骨吸收作用是骨质疏松、类风湿性关节炎、癌症骨转移等疾病的特点,以破骨细胞作为治疗上述疾病的靶细胞,应用OPG阻断RANKL/RANK通路,有望成为一个新的治疗手段。类似BMP的情况,重组OPG蛋白的生产、具有OPG相近功能的小分子物质的合成等有可能成为具有良好经济效益和社会效益的产业。 本研究首先采用RT-PCR方法获得人OPG全长编码区基因:根据文献报道的人OPG cDNA的序列,设计针对其编码区基因的引物,提取OPG基因mRNA表达水平高的人骨肉瘤细胞系MG63细胞的总RNA进行RT-PCR,将扩增得到的基因片段插入克隆载体pUC19中,酶切鉴定正确后进行序列测定,结果证明得到的OPG编码区基因与文献报道完全一致,并且通过引物对基因两侧进行了修饰。 为得到纯化的人OPG蛋白,选用大肠杆菌表达系统中与目的基因同时表达谷胱甘肽转硫酶(GST)的原核表达载体pGEX-4T-1,将OPG成熟肽段基因克隆入编码谷胱 第四军医大学博士学位论文2003 7 甘肽转硫酶的基因下游,转化大肠杆菌,诱导表达了OPG.GST的融合蛋白(分子量约 为 66 ha),占菌体总蛋白的 15.5%,Western blot检测融合蛋白能与 OPG多克隆抗体 产生特异性免疫反应,亲和层析后融合蛋白纯度为gi.7%。OPG蛋白的获得为进一步通 过噬菌体肽库筛选等技术,筛选出能与OPG蛋白特异性结合、具有与OPG相同或相反 生理作用的小分子量物质以及制备OPG抗体奠定了基础。 为研究OPG在真核细胞中的表达,构建了OPG真核表达载体pCDNA3AIPG和 pIRES-EGFP-OPG,转染小鼠胚胎成肌细胞株C2C12,筛选出稳定转染OPG编码区基 因的细胞系,经 Western blot检测证实细胞可稳定表达 OPG蛋白,细胞生长状态良好。 在动物细胞中表达OPG蛋白价格昂贵、蛋白表达量低、不易分离纯化,而原核表 达的蛋白水溶性及生理活性差,为得到有活性的OPG蛋白,选用毕赤酵母表达系统, 将人OPG成熟肽段编码区cDNA克隆入有a-因子信号肽的毕赤酵母表达载体 pPICZ-aA,电转化毕赤酵母菌株GSI 15(Mut”),经浓度为3%甲醇诱导表达OPG与 6xHis的融合蛋白。SDS.PAGE及 Western blot分析表明表达的蛋白分子量约为 66 kDa, 能与人OPG多克隆抗体特异性结合。离心收集表达上清经饱和度为80%硫酸氨沉淀、 透析后,使用 Ni-NTA亲和层祈纯化后蛋白纯度为 84.7%,上清蛋白含量为 18mg/L。应 用小鼠全骨髓细胞体外诱导培养系统,在 l,o25pHhD3*-SM)及地塞米松(l“’M)的 刺激下有破骨细胞样细胞形成,TAsP染色阳性,能在象牙片上形成骨吸收陷窝的能力。 将纯化的 OPG蛋白(浓度 100ng/ml)加入鼠骨髓细胞的培养基中,象牙片上形成的骨 吸收陷窝的数量与玻片上*RAP染色阳性多核细胞的数量均减少(P<0.05),这种作用 可被同期加入的人OPG多克隆抗体桔抗,证实表达的OPG蛋白具有抑制破骨细胞分化 及骨吸收的功能。 基因泊疗具有治疗靶向性、蛋白持续表达、价格低等优点,腺病毒是目前骨病骨创 伤基因治疗研究领域中最常用、较为理想的载体。OPG和 BMP-2在功能上的互补,且 BMPZ可促进OPG的表达,因此联合应用OPG和BMPZ,可以在骨髓微环境中发挥 OPG抑制破骨、BMP-2促进成骨的作用。为研究同时转入外源性OPG和BMP-2基因 对细胞生长的影响,首先构建 BMP-2 和 OPG 的双顺反子真核表达载体 pIRES-OPG-BMPZ,在阳离子脂质体介导下转染CZC12细胞,Western blot检测证实 细胞可稳定表达BMPZ和OPG,流式细胞仪检测细胞生长状态良好。 应用 Adeno-X””腺病毒表达系统,将OPG的编码区cDNA克隆至穿梭质粒pshuttle, 进一步构建重组有 OPG编码区 CDNA的腺病毒 DNA,经 PaC酶切线性化,在脂质体 工仙巾mie丫*n刀Opaedwt FMU 2003 第四军医大学博士学位论文2003 吕 介导下转染HEK293细胞,反复冻融制备重组腺病毒,病毒滴度约为5X106~l.SX10’ pm/m


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