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RANKL,PTHrP及P38 MAP Kinase在破骨细胞生成和骨吸收中的作用

陶惠人  
【摘要】: 多种骨吸收性疾病,包括骨质疏松,牙周疾病,炎症性骨病,骨转移癌等等,都是破骨细胞功能得到加强,破骨活动强于成骨活动而导致的。成骨细胞/骨髓基质细胞表面的RANKL基因(receptor activator of NF-κB Ligand,核激活因子受体配体),又称OPGL/ODF(osteoprotegerin ligand/osteoclast differentiation factor,骨保护素配体/破骨细胞分化因子),是破骨细胞分化和发挥功能的关键基因。RANKL与破骨细胞表面的RANK(receptor activator of NF-κB,核激活因子受体)结合后,刺激破骨细胞前体细胞向成熟破骨细胞分化,也刺激了成熟破骨细胞发挥骨吸收功能。在RANKL/RANK刺激破骨细胞前体细胞向成熟破骨细胞细胞分化的过程中,破骨细胞前体细胞中的P38 MAP Kinase(P38有丝分裂原激活蛋白激酶,P38 Mitogen-Activated—Protein Kinase)信号途径又起着关键的作用。骨保护素OPG(Osteoprotegerin)是RANKL的假目标受体,可以拮抗RANKL的作用。 在骨转移癌中,肿瘤细胞分泌的甲状旁腺素相关蛋白PTHrP(Parathyroid hormone-related peptide),通过刺激成骨细胞/骨髓基质细胞高表达RANKL基因,促进破骨细胞的分化,加强破骨细胞的破骨活动,从而导致骨破坏。 我们使用新的水溶性的P38 MAP Kinase信号途径抑制剂Fr167653来研究:1 这种新的P38 MAP Kinase信号途径抑制剂是否能抑制RANKL及PTHrP诱导的破骨细胞形成 2 P38 MAP Kinase信号途径是否参与了骨髓基质细胞中的RANKL及OPG的基因表达 3 建立PTHrP诱导的局部骨吸收动物模型,研究其血钙水平的变化规律 4 在PTHrP诱导的局部骨吸收动物模型上,使用Fr167653抑制P38 MAP Kinase信号途径能否抑制PTHrP诱导的骨吸收及高钙血症。由于RANKL在破骨细胞生理学中的重要性,我们也克隆表达了该蛋白,为进一步的研究打下基础。 第四军医大学博士学位论文 一.Fr167653对ILANKL诱导的破骨细胞分化的影响 在巨噬集落刺激因子M—CSF的存在下,RANKL可以直接刺激骨髓细胞中的破 骨细胞前体细胞分化成成熟的破骨细胞。在M.CSF存在下,培养鼠骨髓细胞3天后, 收集不贴壁及贴壁较为松散的造血细胞(破骨细胞的前体细胞),继续用RANKL刺 激3天后,大量的抗酒石酸染色阳性的破骨细胞生成。在加入不同剂量的Fr167653时, 即使0.IvM的Fr167653也可以抑制破骨细胞的生成,在10uM的Fr167653的作用下, 破骨细胞数目减少更明显。 H.Fr167653对PTHrP诱导的破骨细胞分化的影响 PTHrP可以直接刺激骨髓细胞生成破骨细胞。鼠骨髓细胞在PTHrP的刺激下培养 6天,大量的抗酒石酸染色阳性的破骨细胞生成。加入不同剂量的Fr167653培养六天 后,计数抗酒石酸染色阳性的破骨细胞数目,0二vM的Fr167653就可以抑制破骨细 胞的生成,10P M的Fr167653几乎完全抑制了破骨细胞的生成。 三.Frl67653对贴壁骨髓基质细胞中OPGAtANKL基因表达的影响 收集骨髓细胞培养10大,每两天换液时轻轻吹打移去不贴壁的造血细胞(破骨 细胞的前体细胞),贴壁的骨髓细胞为骨髓基质细胞。用PTHrP刺激贴壁的骨髓基 质细胞3天和6大,提取RNA,反转录为CDNA后,采用实时荧光PCR检测OPG和 RANKL基因的表达。在PTHrP刺激3天和6天时,骨髓基质细胞中的OPG基因低表达, RANKL基因高表达。加入Fr167653,无论是3天还是6天,即使剂量达10 u M,对OPG 和RANgy基因的表达都无影响。提示P38 MAP inase信号途径并不参与骨髓基质细 胞中OPG和RANM基因的调控。 四.PTHrP诱导的局部骨吸收动物模型的建立 每天注射PTHrP两次,每次9 u g到小鼠的颅骨,分别在3天后的8小时,12小时, 24小时以及5天后的12小时取材。通过X线片和组织学检查,在颅骨部位,均产生了 不同程度的骨吸收。但是,在注射PTHrP三天后的8小时和12小时,骨吸收虽然产生 但不是很显著,至24小时骨吸收明显。在注射五天后,骨吸收非常严重。在注射PTHrP 一天后的3小时,三天后的3小时,6小时和10小时,5天后的列、时和10小时,分别检 测全血内的血钙水平的变化,发现:注射PTHrP一天不能诱发高钙血症;注射PTHrP 3天后产生了明显的高钙血症,高钙血症维持3—6小时后,在10个小时时,成下降趋 势;在注射PTHrP 5天后的3个小时有明显的高钙血症,在10个小时后逐渐下降。这 提示PTHrP诱导的高钙血症水平并不是恒定的,而是呈波动性变化。局部骨吸收在 3 第四军医大学博士学位论文 注射3天后的24小时开始比较明显,在注射PTHrPS大后,可以建立稳定可靠的局部 骨吸收和高钙血症动物模型。 五.Frl67653对PTHth体内诱导的骨吸收和高钙血症的影响, 在体外研究中,Frl67653能够抑制RANKL和PTHrP诱导的破骨细胞形成。在体 内,Frl67653是否能够抑制破骨细胞活动加强而导致的骨吸收呢?我们利用注射 PTHrP到小鼠颅骨建立的局部骨吸收动物模型,研究在动物体内抑制P38 MAP 兄nase是否能抑制破骨细胞活


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