面突外胚间充质干细胞的多向分化及永生化

【摘要】： 干细胞(stem cell)是一种具有多向分化潜能和自我复制功能的未分化细胞，在特定的条件下，可以分化为不同的功能细胞，形成多种组织和器官。胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的分化和增殖构成个体发育的基础；而成体干细胞(adult stem cell，AS)的进一步分化则是成体组织、器官修复再生的基础。研究干细胞一方面可以揭示许多有关生长发育的基础理论难题，另一方面则可用于临床治疗—细胞移植治疗各种疾病和构建人工组织或器官。体外定向分化是干细胞研究和应用的关键，也是生命科学领域的世界性难题。 起源于颅神经嵴的面突外胚间充质干细胞(ecto-mesenchymal stem cell，EMSC)是胚胎颌面发育过程中的暂时性结构，具有向多种细胞分化的潜能，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞、牙乳头细胞、雪旺氏细胞、听神经节等，并将形成上下颌骨、颞下颌关节软骨、牙本质、牙骨质、牙周膜等组织器官，是多能干细胞。作为颌面部多种组织的前体细胞，外胚间充质干细胞在颌面部发育和分化研究中占有重要的地位，并可为组织工程提供可靠的细胞来源，为临床应用奠定坚实的基础。 目前，对外胚间充质干细胞的前体细胞—颅神经嵴细胞进行了定向诱导分化。初步认为，GGF、TGFβs、BMPs等生长因子在体外可影响神经嵴细胞的最终分化。其中BMP-2／4可诱导其分化为神经元，GGF可诱导其分化为雪旺细胞，TGF-β1、2、3可诱导其分化为平滑肌细胞。因此，在体外用各种生长因子进行诱导，外胚间充质干细胞是有可能分化为颌面部发育所需的大部分细胞的。 正常体细胞经过有限的分裂后，会出现衰老、死亡。而永生化细胞具有无限增殖能力。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是目前最安全、可靠的永生化基因。利用hTERT永生化面突外胚间充质干细胞，可 第四军医大学博土学位论文 以克服有限的细胞来源，为基础研究和应用研究提供充足、可靠的细胞来源。 本实验旨在探讨人早期胚胎面突外胚间充质干细胞的多向分化潜能，并对该 细胞永生化进行了初步研究，主要研究内容及结果如下： 一、胚胎面突外胚间充质干细胞的培养及鉴定 50天流产自愿捐赠的胚胎，酶消化法培养面突外胚间充质干细胞，白血病抑 制因子抑制分化。免疫细胞化学法染色显示，细胞表达迁移中神经峭细胞特异的 HNK－l；Vmentin强阳性表达，显示其间充质特性；Vlll因于弱表达；细胞不表达 NF、GFAP、a．SMA、CK。结果表明，所获得的细胞为未分化的外胚间充质干细 胞，为进一步研究其分化特性奠定了基础。 二、外胚间充质干细胞的自发分化 自发分化包括体内及体外研究。 将培养的未分化外胚间充质干细胞注入裸鼠皮下，l 周时部分细胞出现坏死 吸收，2周时无法找到注射的细胞，不排除细胞局部同化现象。 在体外，去除白血病抑制因子后2天，外胚间充质干细胞出现明显向平滑肌 细胞分化的现象，约的％的细胞表达平滑肌细胞特异性标志a－SMA。二周，约有 1％的细胞表达神经纤维细丝蛋白 NF，零星细胞表达神经胶质纤维酸性蛋白 GFAP，同时细胞表达1型胶原。表明外胚间充质干细胞有分化能力，自发分化呈 现向平滑肌细胞优势分化的倾向。 三、外胚间充质干细胞向平滑肌细胞、成骨细胞的诱导分化 利用生长因子法诱导外胚间充质干细胞在体外分化。 免疫细胞化学法图象分析及半定量PCR显示，TGF－日能有效促进EMSC向 平滑肌细胞分化，平滑肌细胞比例由自发分化的65％增加到近95％。 在含p－甘油磷酸钠、维生素乙地塞米松的矿化液中，EMSC被诱导分化为 成骨细胞，碱性磷酸酶活性增强，I型胶原染色阳性，能形成矿化结节，细胞表达 成骨细胞特异的骨钙素。 －4－ 第四军医大学博士学位论文 四、外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞的诱导分化 在转化生长因于pl 和牙本质非胶原蛋白的作用下，细胞在胶原三维培养体 系中呈现成牙本质细胞特异的形态改变，细胞出现极化，胞核位于一侧，另一侧 有很长的突起，细胞平行排列；表达牙本质特异的涎磷蛋白（DSPP）；在矿化液中， 诱导细胞能形成矿化结节；在体内，含细胞的胶原也出现矿化趋势。表明EMSC 己 被成功诱导分化为终末期的成牙本质样细胞。 诱导分化实验表明，外胚间充质干细胞具有多向分化潜能，在体外能被诱导 分化为多种有功能的终末分化细胞。 五、外胚间充质干细胞的永生化 采用脂质体转染法，将编码hTERT和 neo基因的真核表达载体PCIneo山TERT 导入外胚间充质干细胞。＊418加压筛选后，获3个抗性克隆。免疫细胞化学法检 测显示，细胞hTERT活性得以重建，衰老现象得以逆转。增殖能力变强。克隆2 来源的细胞在体外长期培养生长良好，至今己 5个月、49代，越过 MI期，命名 为（hTERTEMSC－2）。该细胞核型正常、在软琼脂内不能生长、无裸鼠致瘤性。 表明转染的细胞是hTERT介导的永生化细胞，?