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MAPK在慢性粒细胞白血病信号转导中的作用及其作用机理研究

尚振川  
【摘要】: 慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种起源于多能造血干细胞异常克隆的恶性增生性疾病,约占成年人白血病的20%~30%,年发病率为1/10~5,在我国白血病中发病率仅次于急粒和急淋而居第三位。常见的临床表现为乏力、消瘦、粒细胞异常增高、脾肿大。CML的自然病程一般为3~5年,可分为慢性期(CP)、加速期(AP)和急变期(BC),晚期70%以上的患者发生急性变或因骨髓纤维化、全身衰竭等原因而死亡。近年来,随着环境污染的加剧以及放射性武器(贫铀弹等)在局部战争中的应用,CML发病率有明显增加之趋势,已日益成为威胁人民健康的一种常见恶性肿瘤。 目前CML尚缺乏可靠的有效治疗,常规化疗很难改变CML的自然病程;α-干扰素也仅能使10%~30%的患者获得短暂的细胞遗传学缓解;异基因骨髓移植(allo-BMT)被认为是目前最有希望治愈CML的方法,但因受患者年龄、供体及移植后严重并发症(GVHD、感染等)等因素的限制,临床上只有20%~30%的患者有可能接受这种治疗;自体骨髓移植(ABMT)相关并发症发生率低, MAPK庄馒殁傲纫懈方血请烊号爹导呻矽形展及算形用硼理研究 不受年龄限制,但由于缺乏有效的骨髓净化措施,移植后复发率高;近两年来 发展起来的BCR/ABL酪氨酸激酶抑制剂STI571被认为是治疗CML的革命性 的分子靶向药物,但由于臼血病细胞迅速产生的耐药性、停药后易复发等,使 其应用受到限制。因此急需积极探求治疗CML的新方法。 CML具特征性的Ph染色体,由其形成的bcr-abl融合基因在CML的发病 中起重要作用。近年来,随着免疫学、分于生物学研究的进步和发展,CML己 成为迄今发病机制研究最透彻的白血病分于模型,这使CML获得了发展合理分 于治疗的良好机会。从分于机理针对CML发病的各个关键环节,研究靶向治疗 药物,发展特异性疗法,彻底消灭骨髓中的白血病克隆,己成为当今CML治疗 研究的热点。 信号转导是指细胞感知胞外刺激后,通过细胞内信号分子的逐级传递作用, 最终诱导产生一系列的细胞质、细胞核内事件和各种生理生化反应的过程。信 号转导在生物体内普遍存在,介导多种细胞生物学效应。近几年,国内外对细 胞信号转导途径的研究取得了很大进展,很多疾病的发生都与异常和(或)错 误的信号转导有关,从理论上讲,阻断其异常和(或)错误的信号转导就有可 能阻止疾病的发生、发展,所以从信号转导通路入手来研究疾病的防治策略己 越来越引起人们的广泛重视。 CML的PZ10蛋白具有异常增高的PTK活性,它可诱发多条信号转导途径 的异常激活,起主要作用的有促进细胞增殖并调节基因转录的Ras-MAPK途径 和调节效应基因转录的JAK-STAT途径,其中MAPK级联反应是这两条信号转 导途径的最后共同通路,它处于关键位置,是CML发病的主要信号转导通路。 可见Ras-MAPK信号通路和CML的发生有密切关系,有关Ras-MAPK信号通 路在CML发病中作用的研究,国内外尚未见报道。 本研究以CML细胞Ras-MAPK信号转导通路中的MAPK为靶点,应用反 义技术,以阳离子脂质体作为转染载体,设计并合成了与mapk mRNA翻译起 始部位的 17个碱基序列互补的反义寡核昔酸(mapk ASO人联合her/abl反义 第四军医大学博士学位论文 博士研究生:尚振川(2003)导师:孙秉中教授5 MAPK $Mop$血疗烊号奔导中肘炉贤及算浓凤挑理殿钴 寡核甘’酸(bCI、/fbi ASO)作用于 CML细胞系 KS62和体外培养的原代 CML骨 髓纠1胞,沤过封闭伙·巾!和mapk基因的表达以在不同环节作用于CML细胞, 惜助MTT、勺-TdR掺入、集落形成、蛋白合成、Y二’P掺入、免疫印迹、RTPCR、 电镜、流式细胞仪、片段DNA含量检测和DNA +J状电泳等试验和手段,从不 同角度,采用多项指标,在细胞、蛋白及分子水平上系统探讨了MAPK在CML 发病。。【I的作用、作用机理及其与h人aM融合基因的关系。结果表明: 1、Y/中掺入法和 FCM测得 KS62细胞 MAPK活性和 MAPK蛋白表达 分别比正常健康人骨髓细胞高2.4倍和5.4倍。 人作用 48 h,2 v mol/L的 mapk基因反义寡核昔酸对 K562细胞增殖、集 落形成、蛋白和 DNA合成的抑制率分别为 64.2o、36.lo、40.3O吞 40.5O, her/abl基因反义寡核昔酸的抑制率分别为sl.8%、46.IO/O、43.2%和57.1%。 3、2 n mol几的 mapk基因反义寡核昔酸作用 KS62细胞 48h,其对 KS62 细胞 MAPK M性、MAPK蛋白表达和 MAPK蛋白含量的抑制率分别为 39.3O。 34.Zo/o和 32.6o,her/abl基因反义寡核昔酸的抑制率分别为 44.9O、36.3o和 36.7%。 4、RTPCR检测结果表明,her/abl基因反义寡核苦酸可以抑制her/abl融 合基因表达,表现为特异性扩增带荧光亮度变弱,紫外分光光度计测得其抑制 率为 63.4%;而 Inapk基因反义寡核苦酸对 her/abl融合基因表达的抑制率仅为 2.IO/O。 5、2 n mol/L的 mapk基因反义寡核昔酸和 her/abl基因反义寡核昔酸作用 K562细胞 48 h,电镜和FCM均检测到细胞发生凋亡,凋亡细胞比率分别为


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