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人类新基因MAGE-H1/Apr-1与APMCF1结构与功能的的初步研究

晏伟  
【摘要】: 随着人类基因组计划的顺利完成,解读基因编码并研究相关基因的功能正成为各国科学家主要的研究方向。目前,在基因功能的研究方面主要包括:基因生物信息学分析、基因表达图谱建立、酵母双杂交系统的应用、基因转染技术、转基因动物和基因剔除技术以及新近发展的RNA干涉技术等。MAGE-H1/Apr-1与APMCF1分别是在凋亡的人白血病细胞系HL-60和人乳腺癌细胞系MCF-7中发现的人类未知功能基因,在本研究工作中,我们克隆了这两个基因并对其结构与功能进行了初步的研究和分析。 一.MAGE-H1/Apr-1结构与功能的初步研究 提取了维甲酸诱导凋亡后的HL-60细胞的总RNA,根据MAGE-H1/Apr-1的cDNA序列设计引物,运用RT-PCR技术扩增出MAGE-H1/Apr-1的开放读框序列并测序。随后,利用生物信息学方法分析了MAGE-H1/Apr-1的蛋白质序列的保守结构域,发现它共有两个MAGE家族结构域,与MAGE家族的A1、B1、C1、D1和Necdin存在较高同源性;在基因进化上,其结构更加近似于MAGE-D1和Necdin,可能是Ⅱ类MAGE家族基因的一个成员。进一步在人基因组数据库利用Blast比较的方法将MAGE-H1/Apr-1定位在Xp11.22。在组织芯片上进行的原位杂交结果显示,MAGE-H1/Apr-1在食管癌和正常肝及肝癌癌旁组织中有表达,而在正常食管粘膜和肝癌组织中没有表达,表明MAGE-H1/Apr-1在表达规律上也属于Ⅱ类MAGE分子。在构建了 第四军区大学俗士学位论文 pEGFP-MAGE-HI 的真核表达载体并转染COSJ 细胞后发现 MAGE-HI /Apr4定位于细胞核。随后我们构建了 MAGE-HI的真核表达 载体pcDNA-MAGE-HI并经脂质体转染肝癌细胞系HepGZ,G418筛选 出稳定表达的单克隆细胞。与对照组相比,稳定转染 pCDNA-MAGE卫 的细胞生长受到抑制,流式细胞术检测发现转染细胞在*期出现阻滞, 说明在体外,MAGE-HI可能在 HepGZ细胞的m 期发挥了抑制肿瘤细 胞生长的作用。 二.AP MCFI结构与功能的初步研究 在提取了维甲酸诱导凋亡后的APMCn细胞总RN A并反转录后, 利用KA*E技术延长了AP**FI的5’端序列,所得序列经与****FI 同源EST序列拼接后得到了 1745hp新的APMCFI CDNA序列,其中包 含一个编码 271个氨基酸的开放读框。在利用人基因组数据库进行 Blast 比较后证明其序列与人类基因组数据库序列100%一致,并将”*01 定位在3q22.2,它覆盖约14.8讪基困组**A序列,至少包含7个外显 子和6个内含子。随后利用Bllt分析了APMCn的核酸与氨基酸序列 后发现它与鼠信号识别颗粒受体p亚基(SR6)分别有86O和89O的同 源性,说明 APMCF可能是编码人信号识别颗粒受体 p亚基的基因。进 一步分析发现APMCFI在不同物种SRg的氨基酸同源性比较中相对保 守,预示它可能存在重要功能。而保守结构域的分析提示 APMCFI 的 67-245位氨基酸存在类似 Arf和hr的,J、G蛋白结构域,并且具有 AT P从DP结合位点,表明它可能是小G蛋白超家族的一个新成员。为此; 我们克隆了***吓1的开放读框序列,构建了它的原核表达载体。在成 功表达了它的蛋白质后,制作了抗****FI的多克隆抗体并验证了杭体 的敏感性与特异性。用该抗体检测了多组织芯片上 APMCF的表达,发 现它可在多种肿瘤和正常组织中表达;进一步分析了它在结肠癌(55例)、 食管癌(53例)、肺癌(57例)、肝癌(53例)和乳腺癌(47例)中的 表达,其表达阳性率分别为800、570、58o、960和34O。说明它可 能和一些肿瘤的生长有潜在的联系。在转染其绿色荧光蛋白的真核表达 载体pEGFP-APMCFI后发现发现APMCFI定位于细胞的胞浆和胞膜。 在此基础上我们构建了真核表达载体 pCDNA-APMC*,为下一步进行体 二I二 贫四旱巴大学记士公位论文 外基因转染打下了基础。


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