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妊高征患者胎盘组织差异表达基因的筛选与确定

李东红  
【摘要】: 妊娠高血压综合症(pregnancy-induced hyperterlsion, PIH)是围产期母婴死亡的主要原因之一。其临床特点为当胎盘娩出后,临床症状和体征多自然消退。这一临床特点表明胎盘在妊高征的发病中起着重要作用。胎盘是体内的临时分泌器官,它的组成相对简单,主要由滋养细胞和血管间质等成分组成;遗传学方面具有父母的特点;相对于母体来讲,是同种移植物。已有大量的证据表明,妊高征胎盘在组织学、病理学、内分泌学等方面与正常妊娠胎盘相比,存在着多方面的差异。导致这些差异的物质基础在于妊高征胎盘组织的基因表达存在着差异。 在人类基因组计划完成后,疾病基因组计划及其相关的表达遗传学研究已经启动,并成为当今分子医学研究的主要内容之一。妊高征胎盘与正常胎盘相比,在基因表达方面有哪些差异?基因表达的差异与妊高征的临床表现有何联系?差异基因表达的产物能否在蛋白水平上分子水平保持一致?为了了解这些差别,同时为了证实这些差别在大范围妊高征病人中具有普遍的意义,我们进行了以下研究: 1 妊高征病人数据库的建立(construction of PIH database)自2001年3月至2002年9月,我们在第四军医大学唐都医院、西京医院、西安市妇幼保健医院、西安市第四医院、西安市纺织医院收集了42例中、重度妊高征病人和孕产次匹配的22例正常产妇的产前、产后临床资料。为了排除子宫收缩对胎盘组织基因表达的影响,所有研究对象为以剖宫产终止妊娠的未临产的初产妇。在严格条件下,收集胎盘组织,液氮中保存过夜后-80℃保存。部分标本在严格 弟。罕匹大牙傅十研宛“位公大 无RNA酶条件下制作石蜡包埋组织块。 2组织芯片的制备,在每张组织切片上选2卡个不同的的视野,以组织直径 为 3nun,间距 lmm制作胎盘组织芯片。 3抑帘消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSll) 在妊高征病人数据库中选取年龄。孕周、手术终止妊娠时间相近的2例重度 妊高征病人胎盘组织提取总RNA。考虑到胎儿表型对结果的影响,2例病人分娩 的胎儿性别不同。变性凝胶电泳显示RNA质量满意后将2例病人胎盘组织总RNA 等量混合,作为tester。 选取4例孕周、年龄与妊高征病人相配对的正常孕妇胎盘组织,提取总RNA。 4例对照分娩2例男性新生儿,2例女性新生儿。变性凝胶电泳显示RNA质量满 意后将4份胎盘组织的总RNA等量混合,作为driver。 利用 Clontech公司(。clontech.corn)生产的KR-selected cDNA Subtraction Kit建立妊高征胎盘组织cDNA消减文库。根据说明书进行正向和 反向两轮消减杂交。正向消减杂交:以病人胎盘组织总RNA为tester RNA,正 常对照总RNA为driver RNA;反向消减杂交:以正常孕妇胎盘组织总RNA为比。ter RNA,妊高征病人总RNA为driver RNA。正向杂交结果为妊高征胎盘组织cDNA 消减文库。 4基因克隆 用Premega公司的T-Aeasy Kit克隆妊高征胎盘组织cDNA文库基因。 5反向点杂交 将转化菌铺板,随机挑选384个白色菌落,摇菌;以菌液为模板,PCR扩增 目的片段,用PCR产物点膜,分别用正向、反向消减的扩增后CDNA文库制备产’‘ 标记探针。反向探针与正向探针在同一条件下与所选菌落杂交。比较杂交信号值, 选信号值差别大于3的菌落测序。 6 DNA序列测定 3 第。罕匡大磅傅士研宛吐磅位伍大 将所选的cDNA片段用T7法测序。将所测序列进行BLASTN同源分析,以同 源性大于95%为标准,初步确定候选差异表达基因。 8选取4例妊高征病人胎盘和4例正常孕妇胎盘。将4例正常胎盘组织总 RNA等量混合作为整体对照,利用上海联合基因公司生产的4000点CDNA表达谱 芯片检查妊高征胎盘差异表达基因。 9反转录聚合酶链反应(RT-PCR) 根据初步筛选出来的差异表达基因,用 RT-PCR方法验证抑制素在 10例妊高 征胎盘和10例正常胎盘的表达。 10根据初步筛选出来的差异表达基因,利用组织芯片,采用免疫组织化学 技术S干法在蛋白水平验证抑制素A、血管内皮生长因子受体1、细胞角蛋白7 在妊高征胎盘组织中的异常表达。 我们所取得的结果如下: 1 由42例妊高征病人和22例正常孕妇的临床资料和胎盘组织构成的数据库 为将来妊高征的研究提供了丰富的素材。用数据库中的胎盘组织制成的 150点的 组织芯片为在大样本中验证候选基因提供了平台。 2用SSH方法建立妊高征胎盘消减。DNA文库,通过基因克隆、反向点杂交、 基因同源分析,初步确定出34条可能的差异表达基因,包括妊娠特异糖蛋白3 基因(BC005924)、癌胚抗原(M37399.1)、丝氨酸蛋白酶抑制素基因(BC012868)、 VEGF受体1基因(AF063657)、卵巢抑制素基因(NM_002192)、细胞角蛋白7基 因(AF509887)、癌胚抗原基因(M37399.1)等。 3用4000点基因芯片检查4例妊高征病人胎盘差


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