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年龄相关性白内障与正常晶状体上皮细胞中差异表达基因的筛选

刘燕  
【摘要】: 目的:老年性白内障,又称年龄相关性白内障(age-related cataract,ARC)是目前世界上主要致盲眼病,在我国约占各种致盲原因的近一半。以往对年龄相关性白内障的研究多从晶状体蛋白方面进行,对晶状体上皮细胞的研究较少。晶状体上皮作为晶状体中唯一有分裂活性的细胞,能分裂分化出晶状体纤维细胞、产生晶状体蛋白,对维持晶状体内环境的稳定,保持晶状体的渗透压、抵抗外来有害因子的损伤起重要作用。研究白内障发生过程中晶状体上皮基因表达的改变,既可以帮助找出年龄相关性白内障致病相关基因,又可以研究其基因表达改变的影响因素,从而从分子水平解释白内障的发生发展机理。有关白内障晶状体上皮基因表达的研究目前报道不多,许多研究 第四军医大学博士学位论文 多从培养的晶状体上皮细胞入手,且处理方式多种多样,包括UV十辐射作用、 H202诱导等,因而研究结论不一。既有一些基因表达的增加,如一些蛋白质 合成和分泌的增加,上皮细胞凋亡增加及C-厂OS基因表达增加;又有基因表 达的降低,如NADH脱氢酶4亚基、细胞色素b的降低等。在对人晶状体上皮 的研究中,Lee报告前极性白内障和核性白内障上皮细胞中纤维连接蛋白、 I型胶原纤维、a-平滑肌蛋白、TGF-日 l、TGF-D 2、TGF-日*型受体的基因 表达有差异。Kan上crow等利用RT-PCR-DD研究年龄相关性白内障有三个高 表达基因和 12个低表达基因。 由于实验的标本不同,处理方法的差异以及筛选方法的不同,目前对年 龄相关性白内障晶状体上皮基因表达的改变研究仍无一个明确的统一结论。 本研究收集年龄相关性白内障与正常晶状体的囊膜标本,利用改良的消减杂 交法为工具,构建人年龄相关性白内障与正常晶状体上皮细胞的差异表达 CDNA文库,筛选年龄相关性白内障与正常晶状体上皮的差异表达基因,并验 证部分基因的功能,以筛选年龄相关性白内障的致病相关基因,为研究白内 障发病机理,防治白内障提供新思路。 方法:首先利用改良的消减杂交法构建皮质性年龄相关性白内障与正常 晶状体上皮的差异表达CDNA文库。先提取白内障组与正常组中的CRNA,对白 内障组用锚定引物法反转录,正常组用普通方法反转录。用正常组CDNA制作 扣除探针,经杂交、过柱、磁珠吸附后进行PCR扩增,并连接、转化完成文 库的构建。由于白内障标本与正常晶状体标本非常有限,在扩增文库的过程 中,又利用了选择性PCR法,去除PCR产物中的小片断后进行第二轮PCI{,使 得文库中的大片段比例大大增加。 其次,为了排除该消减文库中的小的无意义片段及假的差异表达片断, 先对文库中的菌种摇菌扩增,提质粒,酶切鉴定,留>75()hP的片断。再利用 Southern点杂交法对文库中的片断进行杂交。用正常组cDNA制作同位素探 西京医院眼科 〕 第四军医大学博士学位论文 针,与点于膜上的差异片断进行杂交。取杂交阴性的片断进行DNA测序。对 测序结果进行核酸同源性分析,以判断其为何种基因,对新的无同源性的片 断进行局部组成复杂性分析和开放读框分析,再进行蛋白质同源性比较。 最后,为研究差异表达基因在正常晶状体上皮中是否有表达,并进一步 验证其在两组中表达的差异性,对部分差异表达基因进行了原位杂交的验证。 利用地高辛随机引物法标记筛出的CDNA片断,对冰冻切片进行原位杂交,并 进行计算机图像分析和统计分析。 结果:()用改良的消减杂交法结合选择性 PCR法成功构建了年龄相关 性白内障与正常晶状体上皮的差异表达CDNA文库,文库约含4000个克隆, 经酶切鉴定其中大片断比例较高,>乃0加的片断占60%多,习 …的片 断占30%多。u)共从文库中挑克隆约600个,筛出>乃加p的片断叩O个, 用 Southern点杂交法共筛出 150个差异表达片断。对其中 60个片断进行了 测序并经核酸同源性分析,共得到35个基因片段。包括32个己知基因,其 中 20个为功能己知基因片段,12个为序列己知但功能未知片段,另有 3个 新序列。功能己知基因多为与参与细胞转录、代谢等的调节因子,且许多为 全长基因。功能未知或序列未知的稀有基因占 1/3多。(3)对三个新基因的 分析表明,其碱基组成复杂性均)0.95,均有开放读框,编码的蛋白质与己 知蛋白的同源性均>乃%,可以认为其为保守基因。三个新基因均己登录 GeneBank并己获登录号。(4)对部分筛出基因的原位杂交结果显示:死亡因 子相关基因-15、I型胶原基因均在年龄相关性白内障和正常晶状体上皮细胞 中有表达,死亡因子相关基因15在皮质性年龄相关性白内障晶状体上皮细 胞的表达高于其在正常组的表达,而1型胶原基因的表达则未见明显差异。 序列己知而功能未知的C18己知序列在白内障晶状体上皮有表达,但其在正 常晶状体上皮中无表达。三个新序列中,C24号和C57号序列在年龄


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