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基因工程人抗角蛋白抗体在人体组织和细胞内的反应定位及作用研究

卢宁  
【摘要】: 银屑病是一种严重危害我国人民身心健康的慢性反复发作性皮肤病。在我国总患病人数估计有近500万,而且近年发病率还有逐渐上升的趋势。然而,在银屑病的治疗方面目前国内外尚缺少既有效、又安全的药物。因此,研制开发治疗银屑病的高效、特异、副作用小的药物是皮肤科领域的当务之急,也是世界范围内的热点之一。 表皮角质形成细胞过度增生、多种细胞因子和免疫表型的异常分泌和表达是银屑病主要的病理学改变。无论是利用表皮吸附、角蛋白阻断等间接对比法还是利用纯化的抗角蛋白自身抗体(anti-keratin auto antibody,AK auto Ab),亦或使用抗角蛋白单克隆抗体,其可以以剂量依赖的方式抑制角质形成细胞的增殖代谢,提示AK auto Ab对角质形成细胞过度增殖性疾病有抑制作用;AK auto Ab还可以抑制角质形成细胞产生IL-6、IL-8,进而抑制这些免疫炎症介质介导的炎症反应;通过建立银屑病动物模型,观察自正常人血清中纯化的AK auto Ab对银屑病的治疗作用,结果表明AK auto Ab可以促进动物模型银屑病样皮炎的康复;在临床上,给银屑病患者 补充富含该抗体的免疫球蛋白能够明显改善病情。因此提示抗角蛋白抗体 在银屑病的治疗方面具有良好的研究和应用前景。 从正常人血清中纯化AK auto Ah或者用杂交瘤技术制备鼠抗角蛋白单 克隆抗体存在着应用上的困难。从血清纯化抗体受到血液来源的限制,而 且还潜在有安全方面的问题;而鼠单抗则属于异种蛋白,其异源性问题极 大地限制了在临床治疗上的应用。因此,利用基因工程的方法制备人源性 抗角蛋白抗体,能够有效地克服血液制品的局限性,是理想的升级换代产 品。有鉴于此,我们己自半合成噬菌体抗体库中筛选、克隆了一株人源性 抗角蛋白抗体FK3,并成功得到可溶性表达的 Fab段。本研究通过免疫组 织化学和免疫印迹等方法,观察FK3在人体不同组织和细胞内的反应定 位,明确该抗体所识别的角蛋白,并在体外细胞培养实验中初步探讨该抗 体对角质形成细胞增生代谢等方面的作用,为研制开发人抗角蛋白抗体的 基因工程产品奠定坚实的基础。 首先,将FK315原核表达,通过ELISA试验证实所获得的Fab段与角蛋 白具有较高的结合活性和特异性。 其次,应用该抗体对正常人皮肤、正常人其它不同部位的组织以及银 屑病、皮肤鳞癌、基底细胞癌、脂溢性角化病和恶性黑素瘤皮损进行免疫 组织化学染色,观察该抗体在上述组织中的反应定位。结果发现,该抗体 与正常人皮肤表皮不结合,在正常人其他组织中可与食管、支气管及肝脏 等上皮组织发生反应;在银屑病,FK3与表皮全层结合,其中基底细胞 层为强阳性反应;鳞癌和基底细胞癌的癌细胞胞浆均呈阳性反应,脂溢性 角化病的皮损细胞亦呈明显的阳性反应,黑素瘤肿瘤细胞反应阴性,而瘤组 织周围的表皮为阳性。各切片中所见毛囊均呈阳性反应,真皮呈阴性,其 它皮肤附属器未见阳性反应。阴性对照及空白对照未见染色。 再次,应用免疫印迹的方法获得该抗体所结合的角蛋白条带的图片, —— 发现FK3与鼠抗人细胞角蛋白 17MCAb所识别的角蛋白条带相同,通过凝 胶分析软件得到的图表数据证实其所识别的角蛋白相对分子质量为46 000。通过ELISA竞争抑制试验的方法发现鼠抗人细胞角蛋白17MCAb与 FK3之间具有明显的竟争抑制作用,进一步证实了 FK3是抗角蛋白 17(keratin 17,K17)的抗体。 最后,将该抗体作用于培养的人角质形成细胞,在不同浓度和不同的 作用时间应用酶免疫法细胞化学染色、免疫荧光细胞染色法及共聚集显微 镜观察该抗体在角质形成细胞内的反应定位。并应用MTT的方法观察该抗体 对角质形成细胞的增殖活性的影响。结果发现角质形成细胞的胞浆呈明显 的阳性反应,而胞核呈阴性反应,说明基因工程人抗角蛋白抗体FK3能 够进入培养状态下的角质形成细胞的胞浆,而没有进入细胞核,共聚集显 微镜的扫描进一步证明了这一点。MTT实验证实该抗体能明显抑制角质形成 细胞的增殖,而对黑素细胞的增殖没有明显影响。 K17分布于生长期毛囊及一些非角化上皮,正常人表皮并不表达K17, 只有在银屑病皮损区表皮才表达KI7,所以KI7被称为银屑病相关性细胞角 蛋白。在银屑病皮损区,激活的T细胞产生一系列细胞因子,这些细胞回子 与角质形成细胞表面相应受体结合后,可能引起角质形成细胞内角蛋白表 达模式的改变。其中IFN-Y与K17表达的关系己明确,IFN-Y可激活信号传 导及转录激活因子 STATI(signal transducers and activators of transcription),多个STATI结合到K17基因增强子,诱导表皮角质形成细 胞表达K17。其在银屑病中的作用尚待进一步的研究。 通过以上实验我们明确了所获得的基因工程人抗角蛋白抗体FK3为 抗K17的抗体,其对正常人皮肤不起反应,在正常人组织中与食管、支气管 及肝脏组织发生反应,在银屑病皮损中主要定位于表皮基底层,其作用于 细胞浆,对角质形成细胞的增殖具有明显的抑制作用。这些发现为该基因


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