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小鼠神经干细胞培养及缺血皮质神经元对其增殖、分化等生物学特性影响的实验研究

李力  
【摘要】: 神经干细胞研究是当前神经科学的热点之一。神经干细胞被认为是治疗神经系统疾病最有前景的神经移植材料,有望通过细胞替代恢复神经系统功能。神经干细胞具有两个特性:自我增殖和多向分化,正好可以解决神经移植所面临的困难,因而已在神经退行性疾病的神经移植治疗方面大有作为。对于脑血管病(CVD),特别是缺血性脑血管病(iCVD),神经干细胞移植治疗刚刚起步。关于缺血区域的神经元对NSCs增殖、移行以及建立突触的影响如何,鲜有研究。因此,本实验希望通过体外共培养的方法,模拟研究缺血损伤的皮质神经元对外源性NSCs增殖、分化等生物学特性的影响,进而探讨NSCs移植治疗新皮质缺血损伤的可行性。 本实验分为两部分:第一部分包含实验一和实验二,主要内容是神经干细胞体外培养技术的建立,包括分离培养和鉴定;第二部分包含实验三和实验四,进行的是新皮质区神经元与神经干细胞的共培养实验,观察缺血神经元对NSCs的影响。 实验一中,从孕13天的昆明鼠体内取出胎鼠,分离其纹状体细胞,采用含有EGF、BFGF和N_2的无血清培养基DF12(DMEM/F12,1:1), 第 四 军 医 大 学 硕 士 学 位 论 文 一 分别进行原代培养。培养3—5天后,在新皮质、海马和纹状体的培养物 中均见到漂浮的神经球*eurosphere人采用有限稀释法,将挑选出的神 经球消化吹打分散后,以极低密度(5—10细胞/mL)转移接种至96孔板 内,以相同培养基培养3-5天后,观察到由单细胞形成的新生神经球。 实验二中,首先将实验一获得新生神经球转移至经PLL处理过的24 或48孔板内,培养2’J’时后固定,采用抗鼠nestin和羊抗鼠FITC进行免疫 荧光染色。结果:绝大多数神经球呈nestin阳性。将实验一获得新生神经 球转移至PLL处理过的24或48孔板内,更换培养基为含有10%FBS的 DMEM,继续培养4天后,发现大量细胞平贴于培养板底面,突起丛生, 交织成网,分别进行p-tubulinlll、NSE、GFAP。GalC等免疫荧光染色, 各类阳性细胞均可见到。 实验三中,首先从孕18天左右的昆明种胚胎小鼠新皮质区分离出神 经细胞,接种入Millicell(见实验三讨论)中,原代培养三天后加入阿糖 胞昔,似此纯化培养7天后获得较纯的神经元,进行类缺血处理(无糖乏 氧15分钟),然后将其同实验一得到的异体神经干细胞进行细胞隔离性共 培养,同时设立共培养对照组(正常新皮质细胞与神经干细胞的隔离性 共培养)和空白对照组(单独神经干细胞培养),通过MTT法观察各组神 经干细胞的增殖情况,并绘制生长曲线;通过染色计数的方法观察各组 神经干细胞分化为神经元盼惰况(为实验四)。结果:神经干细胞与缺血 损伤的皮质神经元共培养后,增殖速度加快,其相对增长率为0刀575, 7.59天后达最大增长速度。共培养对照组的相对增长率为0刀344,8.47天 后增长速度最大,空白对照组的分别为0.0387和8.引天。处理组与两对照 组有显著差别(尸<0刀5);两对照组之问无统计学差别(P> o.05)。 实验四结果:各细胞爬片上均看到贴壁细胞。贴壁细胞在爬片上分 布基本均匀。神经球可以形成,有少量神经球贴于爬片上,共培养4天 3 第 四 军 医 大 学 硕 士 学 位 论 文 一 后,贴壁细胞数量仍然不多;且实验组和对照组贴壁细胞数量无统计学 差别。共培养8天后,实验组爬片上单个视野平均贴壁细胞总数、NSE 阳性细胞数均较高于对照组(P<0刀5)。 由上述实验结可得出以下结论: 1.从E13,J’鼠纹状体中可以分离出能稳定传代的NSCs。 2.缺血损伤之新皮质神经元可以促进共培养的NSCS的增殖。正 常皮质神经元无此作用。 3.缺血损伤的新皮质神经元能促进干细胞的分化,并增加其向神 经元分化的趋势。 4.可溶性信号分于的扩散,是缺血皮质神经元影响NSCS增殖、 分化的主要方式之一。 5.NSCS移植治疗汇VD导致的新皮质损伤是可行的。


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