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高同型半胱氨酸血症及MTHFR基因与缺血性脑血管病的关系的研究

孙文萍  
【摘要】: 近十年来,血浆中总同型半胱氨酸(tHcy)水平增高作为动脉硬化性脑血管病的一项危险因素越来越受到人们的重视。Hcy促进低密度脂蛋白的氧化,损伤血管内皮细胞,造成内皮细胞功能障碍,并促进血管平滑肌细胞增殖,增强血栓素A2的生成和血小板聚集、凝血因子V的活化等多方面机制引起血管损伤。有研究认为,轻、中度tHcy浓度增高与中风的发生密切相关。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是Hcy代谢途径中的关键酶,一般认为该酶的催化结构域位于N端。N端C677T多态性被认为是导致tHcy升高的主要遗传因素。有关MTHFR基因突变、血浆tHcy增高及脑梗塞之间的关联性,已经引起了众多学者的关注。本课题将这三者之间的联系进行了研究,结合临床与基础研究证明三者之间存在关联性。 目的:①克隆人MTHFR(N)编码基因,表达MTHFR(N)蛋白,为进一步研究MTHFR的功能和结构打下基础;②通过培养的HUVEC,研究不同浓度的Hcy对内皮细胞损伤的影响;③观察FA干预后的HUVEC是否能够削弱Hcy的细胞毒作用;④探讨MTHFR基因C677T和A1298C两个酶切位点多态性与高Hcy血症及脑梗塞的发生之间的关系,确定二者是否为脑梗塞的遗传易感性标志。 方法:①实验一:利用惠赠的质粒扩增MTHFR(N)编码基因,克隆至pGEM-T easy载体并测序,再亚克隆至GST融合表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达GST/MTHFR(N)融合蛋白;②实验二:培养HUVEC细胞,传至第三代后,分成8组,将其与不同浓度的Hcy(0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L、2.0 mmol/L)和FA(0.1 mmol/L)共同培养20小时,分别利用MTT、HE染色、TUNEL染色和流式细胞仪技术观察HUVEC细胞的生长情况和凋亡细胞;③实验三:采用PCR-RFLP分析方法,对西安地区的191例患者进行MTHFR基因C677T和A1298C酶切位点多态性检测,比较二者等位基因频率在脑梗塞组(病例组)和对照组分布上的差异。 结果:①成功构建了GST融合表达载体pGEX-4T-2/MTHFR(N);表达了GST/MTHFR(N)融合蛋白;②HUVEC与不同浓度的Hcy培养20小时后,细胞活力OD值呈现剂量依赖性的降低(p<0.05),凋亡细胞数显著增加(p< 第。军匡大q硕女含伍恰么 0.05人 滞留于GI期的细胞比例增加,FA对 HCy的细胞毒作用有显著的抑 制(p<0.05);④“77T基因型与血浆比,浓度相关,w0.m,与盯 的发生 密切相关,多因素Logistic回归分析结果表明,血浆仇 浓度和C677T基 因突变是队的独立危险因素,OR值分别为 l.031和 1.870。 结论:我们的工作为进一步探索人 MTHFR ()的功能结构及其生物学作 用打下了基础。通过细胞模型说明高浓度的HCy完全能够损伤血管内皮细胞, 而叶酸具有一定的保护机制。结合临床实验结果,表明MTHFR基因突变 (C677T)及HHCy与BI之间有相关性。本项研究的结果为下一步开展BI 的基因遗传学研究、研究高HCy血症的细胞毒、基因毒等致病机制奠定了一 些基础:同时为临床使用叶酸治疗高仇y血症,预防缺血性脑血管病,可 能提供了某些理论依据。


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