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Ecoli YggG功能与其相互作用因子研究

黄勇  
【摘要】: 本课题组在探索大肠杆菌Era结合蛋白工作中发现,位于大肠杆菌基因组第267section处的yggG基因可能是编码Era结合蛋白的基因。我们对YggG序列进行同源性分析时发现,YggG具有金属蛋白酶特征性金属离子结合序列HEXXH,将其归类为金属蛋白酶,但无确切的实验证据。而本课题组前期研究却表明YggG(294aa)蛋白的表达对大肠杆菌以及酵母细胞的生长均具有抑制作用。 因此,yggG的表达特性,便成为其功能研究首先必须确定的问题,但至今只有一篇研究SpeB的文献顺便提及yggG基因在大肠杆菌中的表达,但无相应的实验数据显示。在yggG开放读框中存在着多个可能的翻译起始位点(ATG),能够翻译形成长短不同的蛋白,到底是从哪个ATG开始、形成多大的蛋白?Genbank公布该蛋白的编码基因为885个碱基译码294个氨基酸,SWISS-PROT公布该蛋白的编码基因为759个碱基译码252个氨基酸,前者比后者在氨基端多42个氨基酸,但均无实验证据。 第四军医大学硕士学位论文 所以至今还没有一篇研究YggG功能的文献。 本研究旨在阐明YggG三方面的内容:第一,从不同ATG起 始形成的长度不同的YggG蛋白,其生物学作用有何区别;第二, YggG蛋白在细菌中的表达特性,包括:l、野生型大肠杆菌是否 表达YggG蛋白,及表达特性。2、YggG蛋白从哪一个ATG起始 译码,是否有多个不同长度的YggG存在于不同的细菌生长条件 下;第三,研究YggG与Era蛋白间的相互关系。 为了阐明上述三个问题,将实验分为三部分: 第一部分,研究不同长度YggG蛋白与其生物学作用的关系。 作为与细菌生存必须基因。ra可能相关的yggG基因,其全序列中 存在多个ATG,可形成不同长度YggG蛋白。因此,我们可以通 过研究不同长度的YggG对细菌生长的作用特点,进而研究不同 长度YggG蛋白与其生物学作用的关系,为研究YggG表达特性、 相互作用因子及功能奠定基础。但是,我们前期研究表明,即使 表达微量的YggG,细菌便无法生长繁殖,这使我们的YggG研 究工作无法进行。因此,确定YggG蛋白中对细菌生长有抑制作 用的序列,便成为YggG所有研究中最迫切需要解决的问题。为 此,我们通过PCR扩增不同起始位点YggG蛋白的基因序列,并 分别导入相同的载体,转化相同宿主菌,诱导目的蛋白表达,借 助于细胞生长曲线和电镜,观察表达不同目的蛋白宿主菌的生长 状况及细胞形态。同时对YggG氨基端不同长度截短序列的功能 进行相同的分析,以此确定,YggG(2 94aa)蛋白中对细菌生长有抑 制作用的序列,进而进一步确定不同ATG起始位点形成的YggG 蛋白与其生物学作用的关系。 结果表明,不同ATG起始位点形成的YggG蛋白,对细菌生 存的影响如下:YggG294肤、YggG270肤和YggG252肤均具有 抑菌作用,由氨基端42个氨基酸形成的短肤YggG42也同样具有 抑菌作用,它们的抑菌作用没有明显区别,并且均无法通过 第四军医大学硕士学位论文 SDs一PAGE检测。但是,将氨基端截去63个氨基酸的YggG231 肤却失去了对宿主菌生长的抑制作用,并可通过SDS~PAGE检测 到其在细菌中的表达,由氨基端24个氨基酸组成的短肤YggG24 亦无抑菌作用。由此推断,在YggG蛋白的25一42aa及43一63aa 序列中存在对细菌生长具有抑制作用的基序,生物信息学分析发 现,这两段序列都可形成a螺旋;YggG蛋白作为金属蛋白酶 pePtidase_M48家族成员,具有大多数家族成员的二价阳离子结合 序列HEXXH,本实验中,将YggG蛋白HEXXH序列中的组氨酸 点突变为甘氨酸、谷氨酸点突变为丝氨酸,从理论上使其丧失了 与锌离子结合的能力,现在还无从知晓这种改变对YggG蛋白的 功能有何影响,但本研究结果可以证实,YggG蛋白的HEXXH 基序改变和存在与否对其抑菌作用并无影响。 第二部分为YggG表达特性研究。大肠杆菌中是否表达YggG 蛋白,以何种形式表达,是研究YggG功能的基础。而在某一蛋 白质的表达特性研究中,制备针对该蛋白质的特异性抗体是最为 关键一项的工作。而对细菌生长无抑制作用的YggG231肤的获 得,为制备抗YggG抗体并检测YggG的表达特性提供了极大的 便利。以对细菌生长无抑制作用的YggG231肤为抗原免疫家 兔,制备抗YggG抗血清,再利用敲除yggG基因的DY33O菌的 全菌蛋白吸附,消除交叉反应抗体纯化抗血清,以此抗血清通过 免疫细胞化学的方法检测YggG蛋白在细胞内的定位,通过 Western blot检测YggG蛋白在细菌中的天然表达形式和特点,和 SDS一PAGE检测不到的具有抑菌作用的YggG蛋白,均获得满意 的结果。利用此抗体可明显地检测到第一部分实验中利用SDS一 队GE检测不到的具有抑菌作用的YggG蛋白,包括294肤、294 肤突变体、270肤和252肤,这些毒性蛋白表达后定位于细胞的 细胞膜或壁上,影响细胞的分裂增殖,细胞的形态亦发生明显地 改变;同时,利用抗YggG(23 laa)抗体检测到,野生型大肠杆菌 第四军医大学硕上学位论文 中以及处于高温培养的或紫外线照射下大肠杆菌中YggG蛋白的 表达,其相对分子量均相同,并与YggG(23 laa)相近,可能是 YggG231肤或YggG243肤,由此可以


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