组织工程化软骨修复兔关节软骨缺损及其相关研究

【摘要】：关节软骨损伤的修复是骨科面临的难题之一，目前尚未得到很好地解决。传统的治疗如软骨下骨钻孔、磨削、微骨折等存在一定的不足，自体骨软骨、骨膜或软骨膜移植可造成附加损伤，且其来源有限，异体组织的排异反应问题尚未得到很好解决；近年来组织工程的发展有望成为治疗软骨损伤的新方法。本文从五个方面探讨了用组织工程方法修复兔关节软骨损伤及其相关问题。 1 诱导骨髓基质细胞(MSC)向软骨细胞分化的实验研究 目的：探索用rhBMP-2和高分子透明质酸在体外诱导MSC向软骨细胞分化的可能性。方法：白兔双侧股骨粗隆处抽取4-6ml骨髓后在体外行原代和传代培养，实验分为2组，实验组培养液中含rhBMP-2(100ng/ml)，培养瓶底预涂高分子透明质酸；对照组常规培养及传代。传代细胞爬片行H．E染色、甲苯胺兰染色、碱性磷酸酶染色(ALP)、免疫组织化学染色；培养细胞与聚乳酸／聚羟基乙酸(PLGA)复合后植入自体兔股部肌内，大体及组织学观察形成的结节；测定培养液中的骨钙素。结果：实验组传代细胞，尤其是第3代细胞甲苯胺兰染色阳性，免疫组织化学染色S-100蛋白阳性，Ⅱ型胶原染色阳性，兔股部植入PLGA-细胞后3w形成软骨结节；而对照组免疫组织化学染色个别细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原染色阳性，植入PLGA-细胞后主要形成纤维组织；实验组和对照组均未测到骨钙素。结论：本研究用rhBMP-2和高分子透明质酸有效地诱导MSC向软骨细胞分化，MSC派陸软骨细胞可作为软骨组织工程修复关节软骨损伤的较理想的种子细胞。 第四军医口冤学博d匕学t比七仑二忆 目的:采用体外细胞培养法对两种不同生物材料(PLGA和胶原海绵)的 生物相容性进行研究，探讨它们作为软骨组织工程载体材料的可行性。方法: 选取2月龄新西兰兔，麻醉后在无菌条件下自双侧股骨粗隆处用16号穿刺 针抽取骨髓4一6nil，用D一Hanks液洗涤离心2遍(roo帅m xro而n)，悬浮 于含ro%FBS的DMEM培养液中，行原代及传代培养，将传代细胞以1 .5 x 104/孔定量接种于24孔培养板，每孔加DMEM培养液Inil。实验分为3 组，即PLGA组、胶原海绵组和对照组，其中PLGA组、胶原海绵组分别加 人直径5~，厚度2~大小的材料，对照组单纯接种细胞，于不同时间进 行处理，用于相差显微镜及扫描电镜观察，绘制生长曲线，流式细胞仪 (FCM)检测。结果:骨髓基质细胞可以在胶原海绵和PLGA周围生长，逐 渐粘附，并在其表面连接成片，分泌细胞外基质;对照组与实验组、各实验 组之间生长曲线相近，统计学分析无显著性差异;流式细胞仪检测发现两种材 料对细胞周期无影响，未发现异倍体细胞.结论:胶原海绵和PLGA对兔MSc 的形态学、细胞生长增殖、细胞周期、DNA含量及倍体水平均无影响，两 种生物材料具有良好的生物相容性，可作为软骨组织工程的载体材料安全应 用。 3诱导后骨髓基质细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究 目的:在体外将MSC扩增、诱导为软骨细胞后，探讨以PLGA为载体 修复兔关节软骨缺损的可行性。方法:选取2月龄新西兰兔36只，无菌条 件下自双侧股骨粗隆处抽取骨髓4一6创，行原代及传代培养，传代培养时培 养液中含BMP一2(100n幼al)，培养瓶底预涂高分子透明质酸诱导MSC向 软骨细胞分化。第三代细胞消化、收集后，调整细胞密度为2.0 x IO7lml，与 PLGA共培养24小时，即制成PLGA一细胞复合物。在兔骸股关节股骨裸部 造成直径4~，深达髓腔的缺损，在右侧36个膝关节植人PLGA一细胞复合 物，为实验组，左侧18膝植人PLGA，为单纯载体组，另18膝造成块损后 留作空白对照。术后4w、sw、1 Zw、24w、36w、48w取材，行大体及组织 学观察，组织学评分及统计分析。结果:4w:细胞组(即pLGA一细胞组)缺 损内充填以白色半透明组织，表面光滑，触之较软，稍有凹陷，软骨细胞分 第它g军医口气学博士学位幸仑文 布较均一，排列无方向性;24W:细胞组缺损内充填白色半透明新生软骨组织， 色泽与正常软骨相似，质韧，表面平整，与正常软骨界限消失，表面细胞平 行于关节面，深层细胞排列紊乱，细胞呈团状，基质异染广泛，软骨下骨形 成及潮线恢复正常，与周围正常软骨连接良好。对照组缺损边缘细胞呈团块 状增生，底部为纤维组织。组织学评分经统计学分析，24w、12w分别与4w、 sw和48w时比较具有显著差异(P0 .01)，各时间点实验组与对照组具有显 著差异(P0. 01)。结论:骨髓基质细胞源性软骨细胞是修复关节软骨缺损较 理想的种子细胞;PLGA在新生软骨形成的同时，逐渐降解吸收，是组织工 程修复关节软骨缺损的适宜的支架材料，具有良好的应用前景。 4 PLGA复合BMP修复兔关节软骨缺损的实验研究 目的:以PLGA为载体，探讨rhBMP一2在关节软骨修复方面的作用及 可行性。方法:将PLGA制成直径4~，厚度为3~的圆柱形，与thBMP一2 复合(0 .smgl块)。取2月龄新西兰兔36只，在骸股关节股骨裸部造成直径 4~，深达髓腔的缺损，右侧36个膝关节植人PLGA一BMP复合物，为实验 组，左侧18膝植人PLGA，为单纯载体组，另18膝造成缺损后留作空白对 照。术后4w、sw、1 Zw、24w、36w、48w取材，行大体及组