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细胞增殖负性因子p16和Op18在烧伤愈合及疤痕形成中作用及机理

姚庆君  
【摘要】:瘢痕过度增生(又称病理性瘢痕,包括增生性瘢痕及瘢痕疙瘩)是人类创伤愈合特有的现象,多种细胞参与了创伤愈合过程,而成纤维细胞生物学行为异常尤其是增殖活性异常是瘢痕过度形成的重要原因,成纤维细胞的异常增生使增生性的瘢痕组织中胶原过度沉积、排列紊乱,导致愈后不同程度的畸形与功能障碍。虽然多种内外因素影响创伤愈合的结局及疤痕增生的程度,但除外科手段外,目前仍缺乏有效防治瘢痕增生的方法。近年来尽管有关创伤愈合与瘢痕形成的研究很多,但有关创伤愈合及瘢痕形成的相关理论并无突破性进展,创伤愈合及瘢痕形成中的一些基本问题仍然困扰着临床医师:加速创伤愈合的各种基因工程产品会不会使瘢痕过度增生?除外科手术外其它防治瘢痕的方法介入的时机是否适当?如用药物尽早介入干预瘢痕增生可行吗?如何实现加速创伤愈合与防止瘢痕增生的统一?促进创伤愈合与抑制瘢痕增生对成纤维细胞的增殖来说如同钱币的正反面,正负调控相对平衡与制约使成纤维细胞增殖有度可能是理想的创伤愈合模式。目前为止,尚缺乏在创伤愈合及瘢痕形成中有关负性调控机制的研究。 随着细胞生物学与分子生物学的发展,基因与疾病的关系不断被揭示。基因遗传与疾病发生、易感、药物敏感性有着必然联系,在疾病的不同时期、不同条件基因存在差异表达,瘢痕过度增生作为人类特有的疾病必然存在特有的基因表达,基因表达图谱及图谱中单个基因表达不断变化,构成了创伤愈合及瘢痕形成过程中复杂的、网络化的、相对平衡的调控机制。瘢痕过度增生的发生,本质上是成纤维细胞的调控机制出现了失衡。近年来研究证明,肿瘤发生正是由于调控机制异常导致了肿瘤细胞生长失控,这使得与肿瘤在结构上相似、成纤维细胞在增殖上阶段性相似的瘢痕研究得到启示,两者发生的机制和机理有可能相同或部分相同,把肿 第四军医大学博士学位论文 瘤调控机制的研究运用在瘫痕过度增生的研究中更有可行性。而肿瘤主要 由于负性调控机制异常特别是抑癌基因p16异常所致,初步研究表明,在 瘫痕过度增生的组织中亦存在抑癌基因的异常,而负性调控无论对创伤愈 合基础理论还是临床治疗都具有迫切性与现实性,因此,抑癌基因P16 的研究成为本实验的重点。 在肿瘤中抑癌基因P16主要是发生缺失、突变与甲基化修饰程度增 高:基因全部缺失,无P16蛋白产生;部分缺失或发生突变,可以产生无 功能或功能不全的P16蛋白;基因的甲基化修饰程度越高,p16基因的表 达越低,产生的P16蛋白越少。基因的缺失可以通过基因组PCR发现,突 变可以经过PCR一单链构象多态性分析来检测(PCR一SSCP),甲基化修饰程 度可以通过特定的甲基化PCR(MS一PCR)确定,RT一PCR及western blot 分别测定基因与蛋白的表达。获取人深n“烧伤后创伤愈合早期到后期不 同时间的增生性瘫痕组织标本,动态观察了上述情况,并对不同状态疲痕 组织标本(稳定瘫痕、瘫痕疙瘩、褥疮周围瘫痕)进行了观察。 皮肤移植能有效防止瘫痕增生,但修复时间早晚及皮片厚度与瘫痕增 生程度密切相关。皮肤移植后成纤维细胞的增殖发生了改变,皮肤移植可 能改变了成纤维细胞负性调控机制,证明皮肤移植后负性调控变化有助于 理解负性调控在瘫痕过度增生中的作用。为此,设计了观察不同时间、不 同厚度(刃厚、全厚)皮片移植对负性调控因子的影响,但在临床取得有 时间规律的全厚皮片移植标本存在一定困难,有必要建立稳定的动物烫伤 模型及烫伤后皮肤移植模型来获取标本,经过实验摸索,确立了大鼠的烫 伤模型及烫伤后皮肤移植模型。以往的研究表明,负性调控因子p53、P21 参与了大鼠的创伤愈合,为少走弯路,应用RT一PCR及western blot分别 测定这两种基因从基因到蛋白的表达。 理解负性调控机制的作用,更重要的是为细胞增殖的负性干预打基 础。探索抑制成纤维细胞增殖的多种途径,可以联合应用来增强抑制作用, 也可避免走入崎途。癌基因蛋白18(oncoProteinls,0P18)可以干扰有 丝分裂中的微丝微管形成,可比作生物体内的秋水仙素,研究其在创伤愈 合及瘫痕形成中的作用,为开发相对安全、有效的OP18重组蛋白做基础 工作。应用RT一PCR方法动态观察了Op18在创伤愈合及瘫痕形成中的基因 表达。为进一步了解细胞增殖正负调控之间可能存在的平衡与制约关系, 第四军医大学博士学位论文 在人与动物标本中动态观察了正性调控因子cyClinDI的基因与蛋白表 达。 主要结果如下: (l)制作了一种蒸汽烫伤装置,建立了一种大鼠烫伤模型,使大鼠的烫 伤深度与面积可控,压力为0.12 mPa的蒸汽致伤大鼠,烫伤3秒、 5秒、8秒时分别为浅11“、深11“、1110烫伤模型,使用的2.6 em 烫伤孔相当于2509大鼠体表面积的1%。 (2)制作了大鼠深n”烫伤后的刃厚及全厚皮肤移植模型。 (3)观察到在大鼠的皮片移植后的创伤愈合中:p53、pZI从基因到蛋 白表达出现了从低到高的过程,Cyclin Dl蛋白表达是先高后低的 过程;伤后皮片不同时间(伤后即刻、伤后1周、伤后2周)移植


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