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1Gs恒磁场对共培养内皮细胞增殖活性和膜离子通道的影响

王海燕  
【摘要】:[研究背景] 经皮冠脉介入(PCI)术后再狭窄(RS)严重影响着冠脉内成形(PTCA)术后和支架植入术后的远期疗效,RS是血管壁内一系列分子和细胞事件的级联反应,该反应会出现两个主要变化:血管壁重塑和新生内膜增生。血管壁重塑在动脉粥样硬化中自然发生,支架内再狭窄主要是由于新生内膜的增生。已知的许多预防再狭窄的药物和机械性介入方法还不能取得完全的成功。我科首先提出利用恒磁场(SMF)预防RS,并做了大量相关基础与临床研究。实验表明不同磁感应强度的SMF对体外单独培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs)的增殖活性具有不同的作用。当磁场强度升高到一定程度时,会对体外培养的血管壁细胞产生不利的影响。 目前认为新生内膜增厚与医源性操作引起的内皮细胞(ECs)损伤和功能改变以及由此导致的中层VSMCs迁移和增生关系密切。近来研究表明细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)和细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CKIs)在血管损伤和愈合中起重要作用。本实验旨在通过体外二维共培养模式,模拟在体血管壁细胞间的环境,了解两种来源于人脐动、静脉的血管壁细胞共培养 后对彼此生物学特性的影响,同时研究IGs SMF对该模式下血管壁 细胞增殖活性的影响,并从细胞周期因子的角度进一步探讨共培养 HUVECs的增殖机制。此外还初步研究了共培养和1 Gs SMF对 HUVECs电生理特性的影响。 [方法和内容] 将实验用HUVECs(传代细胞,2一4代)和HUASMCs(传代 细胞,5一8代)分别接种于培养板中,待其铺满培养板底部70% 时,将预先以同样浓度接种于共培养装置中的HUASMCs和HUVECs 置于上述培养板中,培养液同时换为5%新生牛血清的DMEM培养 液,孵箱孵育48h后取出细胞待测。每种实验细胞设6组,单培养和 共培养各3组;单、共培养组中取2组分别在培养24h后加入血管紧张 素11(2 x 10一7pmoLzL)和L一精氨酸(100“moL/L),48h后收集 共6组18孔细胞。各组细胞接种数量由血细胞计数器控制,各组细胞 的接种细胞数和干预培养条件一致。 首先利用四哇盐比色法、3H一胸腺嚓陡核普摄入法和流式细胞仪 细胞周期检测法研究人脐静脉内皮细胞和人脐动脉平滑肌细胞共培 养对彼此增殖活性的影响,并在光镜下观察共培养对二者的生长状 态的影响,同时观察两种常见血管活性物质(血管紧张素n即Ang 11和L一精氨酸)对单、共培养条件下两种细胞增殖活性的影响趋 势。利用免疫组化和原位杂交方法对血管活性因子作用下的单、共 培养人脐静脉内皮细胞的细胞周期相关因子(细胞周期蛋白: CyelinD和CyelinE;细胞周期蛋白依赖性激酶:CDKZ和CDK4:细 胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子:CDKI pZI和CDKI P27)蛋白和 mRNA表达水平进行研究,同时进行凋亡染色检测。 其次,将两种血管壁细胞曝露于IGS SMF共培养48h后,采用 四哇盐比色法、3H一胸腺啥陡核普摄入法和流式细胞仪细胞周期检测 法观察两种细胞的增殖情况,以及此条件下Angn和L一精氨酸对它 们增殖活性的影响趋势。运用免疫组化和原位杂交染色法对血管活 性物质(Angll和L一精氨酸)作用下曝露于1 Gs恒磁场的共培养人 脐静脉内皮细胞的细胞周期相关因子和凋亡情况进行检测。 最后,应用Fluo/AM的负载技术及激光扫描共聚焦显微镜观察 共培养和IGs恒磁场对人脐静脉内皮细胞胞内游离钙离子浓度的影 响,同时观察血管活性物质(AngH和L一精氨酸)对共培养和曝露 于IGs恒磁场共培养人脐静脉内皮细胞胞内游离钙离子浓度的影 响。利用膜片钳全细胞一记录方法,研究共培养和IGs恒磁场以及同 时给与血管活性物质(Angll和L一精氨酸)对人脐静脉内皮细胞膜 背景非选择性阳离子电流的影响。 [结果和结论] 1.人脐静脉内皮细胞和人脐动脉平滑肌细胞共培养,抑制前者增 殖,促进后者增殖;此时二者的生长表型变为静息态,接近于 其体内生长状态; 2.Angll和L一精氨酸干预24h,对单培养和共培养的人脐动脉平滑 肌细胞增殖影响趋势不变; 3.L一精氨酸对单、共培养人脐静脉内皮细胞的促增殖趋势不变: Angil对单培养人脐静脉内皮细胞具有抑制增殖和促凋亡的作 用,但在共培养人脐静脉内皮细胞中上述作用不明显; 4.参与体外培养人脐静脉内皮细胞细胞周期调控的因子包括cyclin D、E,CDKZ、4和CDKI p27。 5.将共培养人脐静脉内皮细胞和人脐动脉平滑肌细胞曝露于IGs恒 磁场48h后,能够显著促进前者增殖而抑制后者增殖: 6.曝露于IGs恒磁场48h不影响AngH和L一精氨酸对共培养人脐静脉 内皮细胞和人脐动脉平滑肌细胞增殖活性的作用趋势; 7.IGs磁感应强度的恒磁场作用48h,可以通过影响人脐静脉内皮 细胞细胞周期相关蛋白的表达影响共培养人脐静脉内皮细胞的 增殖活性,而且减少细胞凋亡发生,可能对共培养人脐静脉内 皮细胞具有一定的保护作用; 8.共培养后人脐静脉内皮细胞的胞内钙离子浓度显著低于单培 养,曝露于IGs恒磁场48h后,细胞[C az+]i显著增加;进一步确 证与人脐动脉平滑肌细胞共培养使人脐静脉内皮细胞增殖活性 受到抑制,而给与IGs恒磁场48h干预后,


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