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外胚间充质干细胞的多向分化及在组织工程周围神经再生中的应用

聂鑫  
【摘要】:在胚胎发育的早期,神经管闭合前,颅神经嵴干细胞向腹外侧迁移到达颌突的中胚层以后,就被称为“外胚间充质干细胞”。起源于颅神经嵴的外胚间充质干细胞(ecto-mesenchymal stem cell, EMSC)是胚胎颌面发育过程中的暂时性结构,具有自我更新和多向分化的潜能,在颌面部的发育过程中可分化为骨源性细胞、软骨源性细胞、神经源性细胞、肌源性细胞等,并将形成上下颌骨、颞下颌关节软骨、肌肉、神经、牙等组织器官。但在体外实验中,很少涉及到外胚间充质干细胞的纯化、培养及多系谱分化,此外组织发育过程中,启动并刺激细胞分化的关于细胞-生长因子、细胞-胞外基质、生长因子-胞外基质的相互作用仍未阐明。以前吕红兵等对外胚间充质干细胞的前体细胞一颅神经嵴干细胞的研究显示GGF、TGF-βs、BMPs等生长因子在体外可影响神经嵴干细胞的最终分化。其中BMP-2/4可诱导其分化为神经元,GGF可诱导其分化为雪旺细胞,TGF-β1、2、3可诱导其分化为平滑肌细胞。邓蔓菁、张光东等也对外胚间充质干细胞的特性进行了初步研究。此外,另一种间充质干细胞-骨髓间充质干细胞也已证实可横向从一种组织分化为另一种组织,这些研究充分证实了外胚间充质干细胞的分化潜能的可行性,也为干细胞用于疾病治疗的潜在应用提供了理论基础。 组织工程产品涉及生物材料、种子细胞及生长因子。其中种子细胞的老化及来源问题一直困扰着组织工程产品的临床应用。干细胞拥有自我更新和增殖旺盛的特点,可为组织工程种子细胞 第四军医人学博卜学位论文 提供新的来源。本课题的目的在于检测外胚间充质干细胞是否具 有多向分化潜能,阐明细胞分化过程中不同生长因子及相关基因 的作用机理及方式。同时对干细胞在组织工程神经在修复坐骨神 经缺损的应用作一简单研究。本实验共分为3部分: 第一部分:未分化外胚间充质干细胞的获取及生物学特性 通过酶消化法初步获取未分化EMSCS,利用不同细胞对消化 的耐受性及干细胞的特性进行进一步纯化。免疫组化鉴定HNK一l 阳性,表明细胞来源于神经峭:NSE,S一100阳性,表明细胞仍 具有神经系统的某些特性;VIM阳性,表明细胞来源于外胚间充 质;GFAP、、NF、CK表达阴性从而排除了其他来源细胞的污染。 EMSCS可通过LIF抑制自然分化的特性,而bFGF能促进细胞的 增殖活性。这些结果有利于我们对EMSCS作进一步研究。 第二部分:外胚间充质干细胞的多向分化潜能分析 在自然条件下,EMSCs可向平滑肌细胞分化,而利用分化抑 制因子LIF可抑制的自然分化趋势,加入TGF一p可促进细胞的分 化趋势,在TGF一p、IGF、维生素C、地塞米松软骨培养液中, EMSCS可被诱导分化为软骨样细胞;加入二甲基亚矾可促进细胞 向成肌细胞的转化,出现肌肉相关蛋白myoD、myogenin、myosin 的表达,用于动物实验可见成肌样结构出现。我们利用大鼠面神 经核团通过RT一PCR方法获取TC 1 ocDNA,利用pcDNA3.1构建了 真核表达载体,通过对EMSCS的转染,细胞出现神经元样变化, 开始表达NF和nestin。此外,我们利用BPE及forskolin使细胞 转化为神经胶质样细胞,并出现GFAP的表达。所有这些结果都 证实EMSCs是一种具有自我更新能力,并可向其他细胞类型分化 的特殊干细胞。 第四军医大学博}学位论文 第三部分:外胚间充质干细胞的多向分化诱导 将牛去细胞基质(BAM)、向神经胶质样细胞分化的EMSCs 按一定的比例混合,注入PLGA神经导管形成凝胶。构建组织工 程神经桥接大鼠坐骨神经缺损,四个月后通过免疫组化、电生理、 透射电镜等方法检测神经再生及坐骨神经功能恢复情况。结果显 示神经已完全连接,疗效好于对照组,表明以外胚间充质干细胞 为种子细胞的组织工程神经对修复神经缺损有较好的疗效。MBP 及GAP一43的免疫组化染色证实组织工程神经修复机理与正常神 经的缺损修复相似。结果表明我们构建的组织工程神经是神经缺 损修复过程中较好的替代品。 综上所述,EMSCS可根据不同要求分化为不同类型的细胞, 这为寻求新的组织工程产品的种子细胞来源奠定了理论基础。


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