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凋亡抑制基因survivin在人骨肉瘤组织中的表达及其RNA干涉的初步研究

杨彤涛  
【摘要】:骨肉瘤是人类最常见的原发性恶性骨肿瘤,最常见于20—30岁的青年人。临床治疗困难,单纯截肢治疗患者常常在一年内死于肺转移。随着外科技术、影像学、化疗放疗的发展,患者长期生存率从10—20%上升到60—70%。但诸如肿瘤转移、复发等问题仍然没有得到完全解决。 研究表明,肿瘤细胞凋亡的减少与肿瘤的发生、发展的密切相关。并且使细胞耐受放疗、化疗的刺激。因而,诱导肿瘤细胞凋亡成为了一种新的杀伤肿瘤细胞的治疗策略。survivin定位于17q25,是一个凋亡抑制基因,属于IAP家族。它编码142氨基酸贱基16.5KD的胞浆蛋白。survivin具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重功能。它抑制凋亡的作用是通过与凋亡效应分子caspase3、7直接结合实现的。所以可以抑制Fas、Bax、caspase分子和抗肿瘤药物引起的凋亡。survivin主要表达在细胞周期的G2/M期,结合与有丝分裂期的微管,不仅参与细胞浆分裂,而且参与细胞有丝分裂的其它诸多方面。分析其表达谱发现,survivin在胚胎和几乎所有的肿瘤组织中表达,但很少见于正常成人组织。在对某些肿瘤的临床研究中,survivin已成为诊断和评价预后的标志物。由于它特异性的表达与促进肿瘤生长的功能,使之成为肿瘤治疗的新靶点。 第四军医大学博士学位论文 研究目的:研究survivin在骨肉瘤中的表达,并观察人骨肉 瘤细胞MG63中反义RNA和siRNA对survivin表达的抑制作用。 研究方法:1.对74例骨肉瘤患者的临床病理资料进行回顾性 分析。应用survivin的抗体对上述患者的肿瘤组织切片进行免疫 组织化学染色并进行统计学分析。2.培养骨肉瘤细胞MG63,采 用Rl飞PCR的方法克隆人survivin基因编码区。DNA。构建survivin 的反义诱导表达载体。转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的 细胞系。稳定转染的细胞系,以120林mol/l Znso;诱导,进行HE 染色、survivin免疫细胞化学染色,透射电镜等形态学观察。同时 绘制生长曲线。RT.PCR检测各组细胞survivin的表达。AnnexinV 法检测细胞凋亡。3.应用psileneer 3.0一HI neo,构建survivin特 异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的 细胞系。对各组细胞进行HE染色、透射电镜等形态学观察。应 用RT一PCR、间接免疫荧光法、western blot分别检测survivin的 mRNA和蛋白的水平变化。流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期 变化。MTT法检测顺铂对细胞的杀伤作用。最后,进行裸鼠体内 成瘤实验。 研究结果:1:74例标本中58例为阳性,总阳性率为78.4%。 survivin的表达与患者年龄、性别、骨肉瘤亚型无明显关系。但与 Enneking外科分期有关,I一IIA与IIB一川之I司,肿瘤survivin表达率 差异明显(P0.05)。2:采用Rl’- PCR从MG63细胞mRNA中扩增了 survivin编码区eDNA,约42obp,纯化后克隆到puelg刀amHI和 EcoRI位点中,测序正确。之后又反向克隆到pMDNA3中,构建 了pMDNA3一anti一survivin重组质粒。转染MG63细胞,G4ls 1000林g/ml筛选4周后,建成稳定转染细胞系。通过ZnSO;120 林mol八诱导,可见MG63zpMDNA3一anti一survivin细胞出现凋亡。电 子显微镜观察表明,部分细胞膜表面微绒毛消失,细胞膜表面出 泡,染色体凝集。与同时期转染空载体组相比,转染 第四军医大学博士学位论文 pMDNA3一anti一survivin组细胞数量减少。半定量PCR检测显示诱导 后survivin mRNA明显减少,免疫细胞化学染色可见诱导后的 Mo63/pMDNA3一anti一survivin survivin蛋白表达明显降低。经流式 细胞仪检测后发现,pMDNA3一anti一survivin细胞,在Znso;诱导4sh 后凋亡率达到11%。较对照组细胞凋亡率高出3倍。3:根据survivin 核普酸序列设计两对survivin特异的 RNA干涉片段PsvA和PsvB,退 火后克隆到psileneer 3.0一HI neo BamHI和Hind 111酶切位点之 间。测序正确。将阴性对照质粒、PsvA和PsvB分别转染MG63细 胞,G4 1 8 1000拼g/ml筛选,约4一6周后建成稳定细胞系。细胞形 态观察发现,MG63用svB部分细胞变得较大,而扁平,并失去短 梭形的特点。其它细胞形态上未见明显变化。与正常MG63细胞、 阴性对照细胞和MG63用svA相比,MG63用svB生长曲线则十分平 缓,0.5 xl护细胞接种于6孔板,7天后细胞计数只能到达2.6 x 10, 细胞,与其余3种细胞则为8xl护左右,存在显著差异(P0.01)。 共聚焦显微镜观察,阴性对照细胞、MG63用svA与正常MG63细胞 survivin荧光信号主要位于胞浆中,呈弥散状分布,信号较强,而 MG63用svB,基本上见不到绿色荧光信号。四种细胞RNA经RT-PCR, 正常MG63、阴性对照细胞和MG63/P svA均有约420bp特异的 survivin DNA条带,强度基本一致,MG63/PsvB仅有非常微弱的条 带。四组PCR样品均有约SOObp大小的强度一致的卜actin片段出 现。四种细胞裂解后各100 09蛋白样品,经巧%sDS一队GE电泳, western blot显示正常MG63、阴性对照细胞和MG63中svA三者 survivin蛋白条带(约1 6.SKD)明显存在,且基本一致。而MG63/PsvB 同样位置的条带基本消失。正常MG63、阴性对照细胞和 MG63/P svA细胞周期变化不大,而MG63/PsvB Gl明显抬高达到 74.2%,下降达到


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