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人前列腺癌相关基因UROC28功能的初步研究

王春杨  
【摘要】:目的:前列腺癌是目前最重要的危害欧美国家男性健康的肿瘤疾病,在我国发病率也呈上升趋势。前列腺癌肿瘤标志物中,PSA的应用最为广泛,但并不十分完善。寻找一些敏感性高、特异性强的前列腺癌肿瘤标志物一直是众多学者的挑战。UROC28基因是2000年克隆并报告的一个新基因,在正常和良性前列腺增生组织(BPH)中仅有少量UROC28表达,在前列腺癌组织中则有明显高的表达,而在转移性前列腺癌中表达量最高,随着Gleason分级的增高而升高。另外在血清样品进行了UROC28蛋白的western blot检测,正常组与PCa组比较,均具有极显著差异(P<0.0001),这些初步结果提示,UROC28很有可能单独或与其他指标如PSA联合使用,成为新的肿瘤标志物。研究UROC28的功能,显然具有很大意义,本实验将对此作初步的探索。 方法:本实验共分七个部分完成: 1.利用生物信息学分析方法分析UROC28基因和UROC28蛋白。 2.PCR获得UROC28片段后,插入质粒,构建pRSET-UROC28原核表达载体,并在BL21工程菌中表达,摸索高表达所需试验条件。利用Ni~(2+)-NTA树脂纯化UROC28蛋白。 3.免疫新西兰白兔制备并纯化兔抗UROC28多克隆抗体。 4.构建pcDNA-UROC28真核表达载体,并稳定转染真核细胞。在 常四军眨大月卜们卜日七学位论文 人胚肾细胞系HEK293细胞和前列腺癌细饱系PC一3细胞中观察 UROC28过表达对真核细胞的生物学作用。 5.构建pWHI一UROC28干涉载体,并在前列腺癌细胞系PC一3细胞 中观察干涉UROC28后的生长曲线、细胞形态学、细胞周期变 化。 6.构建pEGFP一URoc28绿色荧光蛋白融合表达载体,转染HEK293 细胞和PC一3细胞,证实UROC28细胞定位。间接免疫荧光和 DAB显色免疫组化观察,进一步证实UR叱28亚细胞定位。 7.在前列腺癌和良性前列腺增生组织标本中对UROC28进行了免 疫组化染色。 结果: 1.获取了乙珊叱召口基因和UROC28蛋白部分预测信息.乙呀反龙8基因 的同源性分析结果中,其染色体定位与如邵一24。除人类染 色体6q23序列以及uRoc28蛋白本身之外未发现有高同源性核 昔酸序列。URoc28蛋白氨基酸总数135,蛋白为可溶性,预 测分子量:15721,6,预测等电点为9.77,对蛋白纯化条件 的摸索提供了依据;定位于核内可能性为65.2%,线粒体为 30.4%,细胞骨架4.3%,为下一步基因的细胞定位提供了佐 证;同时预测到两个跨膜区,第114个氨基酸由内向外的跨 膜区更是达到了836的评分,具有较高可信性。 2.经酶切、测序鉴定证实,成功构建了PRSET一URoc28原核表达 载体,并经IPTG诱导后在BLZI工程菌中获得22 x 103kDa大小 的URoc28融合蛋白的高效表达产物,薄层扫描显示表达量达 到全菌总蛋白的40%,并利用NiZ+一NTA树脂纯化UROC28蛋 白。 3.免疫雄性新西兰白兔,成功制备了抗眼优28多克隆抗体。并 经大肠杆菌BL21全菌蛋白去除非特异性抗体纯化了多抗,经 western blotting检测,抗体特异性好,效价高,初步应用 布四军民J吮月卜们卜士攀亡之今仓文 于细胞和组织标本检测UROC28蛋白,获得了预期的阳性染 色。 4.成功构建了pcDNA一UROC28真核表达载体,经酶切、测序鉴定 序列完全正确:转染真核细胞,G418抗性克隆中Westemblot 检测真核细胞中URoc28的阳性信号,获得IURoc28高表达的 HEK293细胞模型和PC一3细胞模型,并进行下面的步骤。 5.经G418压力筛选后,在HEK293细胞和PC一3细胞中观察了 UROC28高表达对真核细胞的生物学作用。在两种细胞中都证 实,相对正常细胞和空载体转染细胞,UROC28的稳定转染能 够影响细胞生长曲线,“S”形曲线左移,呈生长加快的趋 势;流式细胞仪检测细胞周期改变:Gl降低,G2期抬高,增 生指数升高;同时电镜观察到细胞分裂相极多见,核仁增大 增多,核浆比例增大,呈增殖旺盛表现。 6.成功构建了pWHI一U尺OC28干涉载体,转染PC一细胞,获得 UROC28干涉的 PC一3细胞模型。观察了干涉UROC28后PC一3细胞 的生物学改变,MTT细胞生长曲线和细胞周期检测未见明显 改变,但证实干涉UROC28后,细胞出现大量的溶酶体,表现 出代谢降低的超微结构变化。 7.荧光显微镜成功的在稳定转染pEGFP一UR沈28的HEK293细胞和 PC一3细胞中观察了绿色荧光蛋白,空载体对照组中,荧光均 匀分布在细胞中,两种类型的试验组细胞中都证实绿色荧光 主要定位在细胞核。 8.转染UROC28的HEK293细胞与PC沼细胞间接免疫荧光观察结 果,红色荧光的UROC28亚细胞定位以胞核为主。 9.转染UROC28的HEK293细胞与PC一3细胞的UROC28免疫组织化学 DAB染色结果,棕黄色阳性染色出现在细胞核区域。 10.在前列腺癌和良性前列腺增生组织标本中对URoc28进行了免 疫组化染色,证实UROC28在前列腺癌腺上皮细胞中高表达, 布四军医,悦月卜们件士攀位伦文 且在前列腺癌与前列腺增生标本中,染色


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