COX-2抑制剂与Survivin反义寡核苷酸联合应用对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其相关机制的研究

【摘要】：目的：1、探讨环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、凋亡抑制蛋白Survivin在胰腺癌组织中的表达与胰腺癌临床病理特征和生物学行为之间的关系及其与血管内皮生长因子(VEGF)、p53和ki67表达的关系。2、探讨COX-2抑制剂Celecoxib(塞来昔布)和顺铂联合应用对胰腺癌BxPC-3细胞增殖、凋亡的影响。3、探讨凋亡抑制蛋白Survivin反义寡核苷酸(ASODN)对胰腺癌BxPC-3细胞Survivin mRNA的表达及细胞增殖、凋亡和对吉西他滨化疗敏感性的影响。4、探讨联合应用COX-2抑制剂Celecoxib和Survivin ASODN对胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其相关凋亡机制的研究。 方法：用免疫组织化学Envision法对51例胰腺导管癌和11例癌旁非肿瘤胰腺组织中的COX-2、Survivin、VEGF、p53和ki67表达进行检测。分别用Celecoxib、顺铂、吉西他滨及用脂质体瞬时转染法介导Survivin反义硫代磷酸寡核苷酸处理胰腺癌BxPC-3细胞，用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的相对存活率、流式细胞术检测细胞凋亡率、Hoechst-33258染色和透射电镜显示细胞凋亡形态，半定量RT-PCR检测COX-2、Survivin、及凋亡相关基因Bcl-2、Mcl-1 mRNA的表达，用Caspase-3比色试剂盒检测Caspase-3活性。采用SPSS10.0统计学软件，用x~2检验和Spearman等级相关分析，均数的比较采用t检验。 结果：51例胰腺导管癌中COX-2、Survivin、VEGF、p53蛋白的 第四军医大学博士学位论文 表达率分别为74.5%、80.4%、68.6%、60.8%;ki67平均标记指数为26.52 士12.22;在n例癌旁非肿瘤胰腺组织中均未发现以上基因的阳性表达。 COX一的表达与临床分期和淋巴结转移有关(只0.05)，而与组织学分级 关系不大(乃0.05);S盯vivin的表达与组织学分级有关(只0.01)，而与 l庙床分期和淋巴结转移关系不大(乃0.05);vEGF的表达与临床分期、淋 巴结转移有关(只0.05)，而与组织学分级关系不大(P0.05);P53的表 达与淋巴结转移有关(只0.05)，而与组织学分级、临床分期关系不大 (乃0.05)，所有基因的表达与患者的性别、年龄、肿瘤的大小、部位均 无关。Spearman等级相关分析发现，COX一2和Survivin的表达分别与 VEGF、p53及ki67增殖指数密切相关，而且COX一2和Survivin之f司的 表达存在明显的相关性(只0.01)。 Cel ecoxib作用于BxPC一3细胞后，细胞的存活率呈剂量和时间依赖 性，其中24h的IC50值为100叫;用100刚Celeeoxib作用BxPC一3细 胞24h，可明显降低BxPC一3细胞COX一2 mRNA的表达，其中实验组和对照 组COX一2/刀一aet in分别为0.31士0.03和0.86士0.06，两者之间差异具有 显著性(尸0.01)。单独应用80刚Celecoxib细胞的存活率为70，68% 士3.37%;单独应用不同浓度的顺铂(l卜g/ml、2.5林g/ml、5瑰/ml、10林g/ml、 巧陀/m1)细胞的存活率分别为88.41%士2.84%、56.38%士1.28%、50.35% 士1.78%、45.0钱士3.91%、40.00%士2.38%;80叫Celeeoxib和不同浓度 的顺铂联合应用，细胞的存活率分别为:53.54%士3.08%、37.7%士2.22%、 32.51%士1.24%、29.55%士1.08%、25.53%士2.32%;联合实验组与单独应 用二者相比均能明显降低细胞的存活率，差异均有显著性(尸0.01)。 不同实验组(①对照组、②100刚eeleeoxib、③5陀/ml JI项铂④100刚 eeleeoxib+5瑰/mlJ顿铂)作用BxPC一3细胞24h，流式细胞仪检测细胞凋 亡率分别为0.25%士0.07%、14.55%士0.35%、8.95%士2.75%、22.2%士 1.27%，其中各实验组与对照组相比以及联合用药组与单独用药组相比， 均具有显著性差异(P(0.01)。Hoechst一33258染色可呈现凋亡的形态学 改变。 Survivin ASODN作用于BxPC一3细胞后，细胞的存活率呈剂量和时 间依赖性，其中24h的IC50值为4O0nM。在此浓度和时间下，Surviv加 4 第四军医大学博士学位论文 ASODN可明显降低Survivin mRNA的表达，ASODN组和对照组的 Survivin/刀一aetin分别为0.26士0.03和0.85士0.03，两者之间差异具 有显著性(尸0.01)。流式细胞仪检测凋亡率为24.93%士2.97%与对照组 (凋亡率0.70%士0.78%)相比，差异具有显著性(p0.01)，在透射电 镜下BxPC一3可呈凋亡的早期改变。在48h和72h，40OnM Survivin ASODN转染组细胞的存活率分别为:45.02%士3.65%和40.73%士2.84%; snM吉西他滨组细胞的存活率分别为75.75%士3.02%和71.65%士3.20%; 在联合实验组中，Surviv加ASODN+吉西他滨的细胞存活率分别为27.36% 士1.27%和巧.65%士1.15%;在同一时相，联合实验组与二者的单独实验 组相比均能明显降低细胞的存活率，差异均有显著性(尸0.01)。ASODN 和吉西它滨的联合实验组与单独应用吉西他滨相比，在48h和72h，可使 细胞的存活率分别降低2.76和4.58倍。 24h时，单独应用80幽Celeeoxib细胞的存活率为71.03%士2.16%; 单独应300nM Survivin ASODN，细胞的存活率为63.33%士4.48%、二者联 合应用细胞的存活率分别为:40.99%士0.38%。48h时，单独应用80刚 Celeeoxib细胞的存活率为61.64%士1.67%:单独应用300nM Survivin ASODN，细胞的存活率为54.99%土3.0%、二者联合应用细胞的存活率分别 为:34.24.%士1.10%。在24h和48h，联合