小鼠生发泡完整卵母细胞中母源基因克隆、定位和功能

【摘要】：目的： 伴随卵母细胞生长的是核糖体和mRNAs转录活化，小鼠大约在排卵前6天，卵母细胞生长和分化结束而达到成熟，此时卵母细胞中合成和积累了多种RNA、蛋白质和细胞器，这些构成了早期胚胎发育的母源物质。胚胎发育从受精开始，新受精卵中就存储大量的母源物质，随着胚胎进一步发育，母源mRNAs逐渐消耗，必然需要合子基因组的适时表达并完全取代之，以实现由母型向合子型调控过渡，缺乏合子基因组激活的动物胚胎无法进一步发育。已有研究表明，小鼠合子基因组激活发生于1-细胞晚期，从未受精卵到单细胞胚胎是母源物质控制，由母源物质支持并指导了早期胚胎发育直到合子基因组激活。因此，母源物质对早期胚胎发育的作用日益受到重视，但对早期胚胎发育或对卵母细胞向合子过渡有影响的作用的母源基因极少被克隆或识别。所以，我们以生发泡完整卵母细胞(GV卵)为检测子，8-细胞胚胎为驱赶子，应用抑制消减杂交技术建立GV卵中母源基因的消减cDNA文库，从中获取小鼠母源基因，为进一步研究母源基因在卵母细胞的发育成熟、早期胚胎发育和合子基因组激活中的作用奠定基础。 方法： 第四军医大学博士学位论文 1、应用抑制消减杂交技术(SSH)，以生发泡完整的卵母细胞 为检测子(Tester)，8一细胞胚胎为驱赶子(Driver)，建立GV卵 母源基因的消减cDNA文库。通过斑点杂交法进一步筛选GV卵 中母源基因的消减cDNA文库，对阳性克隆进行序列测定和同源 性分析:并随机选取3个克隆，以其cDNA序列为基础设计引物， 采用Rl飞PCR方法对SSH的结果进行验证。 2、根据小鼠Peroxiredoxin 11 mRNA序列(Aeeession No: BC002034)设计引物，对小鼠生发泡完整卵母细胞(Gennlnal vesicle intact ooeyte，Gv卵)中的Poroxiredoxin xx可能编码区进 行扩增。另外取小鼠的卵巢，石蜡包埋切片，分别应用原位杂交 方法和免疫组织化学染色观察Peroxiredoxin 11 mRNA和蛋白在卵 巢各级卵泡中的分布。同时，运用RT-PCR和免疫细胞化学染色方 法观察Peroxiredoxin 11在植入前胚胎的表达。 3、收集昆明白小鼠的单细胞受精卵，采用微滴培养法连续培 养48h，观察Peroxiredoxin 11抗体对胚胎发育的影响。应用共聚焦 扫描显微镜术结合特异性荧光探针2’，7，二氯荧光黄双乙酸酷，观 测PeroxiredoxinH抗体对小鼠胚胎中活性氧自由基水平的影响。 结果: 1、SSH和斑点杂交法获取40个阳性克隆，经cDNA序列分 析，其代表18个已知基因和8个EST序列。RT一PCR显示，随 机所选取的3个基因在GV卵中有表达，而在8一细胞胚胎中不表 达。 2、从GV卵中扩增所得684bp的cDNA序列，与小鼠 Peroxiredoxin 11(Aeeession No:BC002034)具有99%同源性;其 推测的编码氨基酸序列与小鼠PeroxiredoxinH氨基酸序列 (Aeeession NO:Q6 1 1 72)完全相同。 3、在小鼠卵巢内，原始卵泡的初级卵母细胞未检到 Peroxiredoxin n mRNA的杂交信号，初级卵泡的初级卵母细胞可检 第四军医大学博士学位论文 到Peroxiredoxin H mRNA的杂交信号，次级卵泡和近成熟卵泡中 卵母细胞的杂交信号明显增强。从原始卵泡到近成熟卵泡周围的 卵泡细胞均可检到Peroxiredoxin n mRNA杂交信号，其信号强度 在卵泡发育成熟过程中未见有明显变化。其次，生后3天小鼠卵 巢未见Peroxiredoxin 11免疫阳性反应:在2月龄小鼠卵巢内， PeroxiredoxinH免疫阳性反应见于初级卵泡、次级卵泡和近成熟 卵泡中卵母细胞，卵母细胞的Peroxiredoxinn免疫阳性反应均分 布在胞质，核呈PeroxiredoxinH阴性反应。各级卵泡周围的卵泡 细胞中未见Peroxiredoxin 11免疫阳性反应。 4、又1’- PCR结果表明:Peroxiredoxin 11 mRNA在GV卵中处 高水平，从Mn卵开始略有下降，在4一细胞胚胎和早期囊胚期间 未检到Peroxiredoxin 11 mRNA;免疫细胞化学染色显示:GV卵、 MH卵、1一细胞胚胎、2一细胞胚胎、4一细胞胚胎、8一细胞胚胎、桑 堪胚和早期囊胚均呈Peroxiredoxinll免疫阳性反应，免疫阳性反 应强度从4一细胞胚胎开始略有下降。 5、对照组和Peroxiredoxin 11抗体添加组的1一细胞胚胎经24h 培养后大部分发育成2一细胞胚胎，对照组和抗体添加组达到2一细 胞发育率都在%%以上。但经48h培养，抗体添加组的胚胎发育 明显受抑，多数停滞于2一细胞时期。激光共聚焦成像的结果表明， peroxiredoxin 11抗体添加组的l一细胞胚胎经24h培养发育成2一细 胞胚胎，其荧光强度明显增强，荧光强度值与对照组相比显著升 局。 结论: l、应用抑制性消减杂交技术，我们成功建立小鼠GV卵中母 源基因的消减cDNA文库，为我们进一步研究母源基因在卵母细 胞和早期胚胎发育中的作用奠定基础。 2、peroXiredoxin 11 mRNA是母源性遗传信息，小鼠卵巢内 Peroxiredoxin H mRNA的转录和蛋白翻译始于初级卵泡中的卵母 第四军医大学博士学位论文 细胞，并持续到近成熟卵泡。Peroxiredoxin蛋白是母源性蛋白，植 入前胚胎中的Peroxiredoxin 11蛋白来源于Mll卵。 3、Peroxiredoxin 11抗体可引起2一细胞胚胎发育阻滞，其作用 是通过升高胚胎细胞内的活性氧水