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神经保护剂联合应用对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究

曲友直  
【摘要】:目的: 脑缺血再灌注后的级联反应对神经元的结构完整及其正常功能具有重要作用,该级联反应主要涉及氧自由基的产生、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸的毒性作用、炎症反应、细胞凋亡等多个环节。针对级联反应单一环节的神经保护剂由于不能完全、有效地阻断脑缺血再灌注损伤的级联反应或存在严重的剂量相关毒副作用,使其临床应用受到限制,因此神经保护剂的联合应用成为目前研究的热点。本研究通过观察:①NMDA受体拮抗剂MK-801、自由基清除剂NAC、降纤溶栓药降纤酶合用对局灶性脑缺血再灌注后脑梗死体积、神经细胞和血管内皮细胞凋亡及MAP-2、Bcl-2蛋白表达、血浆ET-1含量的影响;②钙离子拮抗剂尼莫通及自由基清除剂甘露醇合用对局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及脑组织MDA、NO含量的影响;③活血药川芎嗪及益气药黄芪合用对局灶性脑缺血再灌注后脑组织MPO活性、TNF-α、IL-1β含量的影响,探讨针对级联反应单一环节的神经保护剂联合应用对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。 方法: 采用Longa报道的颈外动脉栓线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。本研究共分三部分进行:①制备局灶性脑缺血2h 第四军医大学博士学位论文 再灌注6h及24h模型。根据所测指标不同,将实验动物分为TTC 染色和ET一1含量测定组、TL加EL和MAP一2染色组、Bcl一2染 色组。每组均再随机分为假手术组、模型组、MK一801组、NAC 组、降纤酶组及三药合用组。分别采用TTC染色法及放射免疫 分析法测定脑梗死体积及血浆ET一1的含量;采用末端脱氧核糖 核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法检测神经细胞及血管 内皮细胞的凋亡;采用免疫组织化学与医学图像分析相结合的 方法检测脑组织MAP一2、Bcl一2蛋白阳性细胞的数目及平均灰度 值。②制备局灶性脑缺血Zh再灌注24h模型。将实验动物分为 假手术组、模型组、小剂量甘露醉组、大剂量甘露醇组、尼莫 通组及两药合用组。每组取6只大鼠采用荧光标记的末端脱氧 核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法检测凋亡神经细 胞,每组取另外6只大鼠采用硫代巴比妥显色法及硝酸还原酶 法检测脑组织MDA、NO含量。③制备局灶性脑缺血2h再灌注 6h及24h模型。分为假手术组、模型组、川芍嗦组、黄蔑组及 两药合用组。分别采用放射免疫分析法、酶联免疫吸附法及分 光光度法检测脑组织TNF一Q、IL一lp的含量及MPO的活性。 结果: 1.模型组大鼠缺血侧脑组织梗死体积明显,为219.7士 26.1~,。MK一801组、NAc组、降纤酶组及三药合用组梗死体 积分别为229.1士25.8 mm3、1403士ZI.smm3、122.2士23,6mm3 及91.2士11.7mm,,与模型组比较梗死体积均显著减少(P0.01), 其中三药合用组分别与MK一801组、NAC组、降纤酶组比较梗 死体积最小(P0.05)。 模型组大鼠缺血侧脑组织与假手术组假手术侧比 较,TUNEL阳性神经细胞及Bcl一2蛋白阳性细胞数目显著增多 (P0.01),Bcl一2蛋白阳性细胞平均灰度明显降低(P0 .01), MAP一2蛋白阳性细胞平均灰度值明显升高(P0 .01)。MK一801 第四军医大学博士学位论文 组、NAC组、降纤酶组及三药合用组分别与模型组比较,Tl~)NEL 阳性神经细胞数目减少,B‘,一2蛋白阳性细胞数目增多、平均灰 度降低,MAP一2蛋白阳性细胞平均灰度值减少(P0.01)。三药 合用组分别与MK一801组、NAC组、降纤酶组比较,TtjNEL阳 性神经细胞数目显著减少,Bcl一2蛋白阳性神经细胞数目显著增 多、平均灰度明显降低,MAP一2蛋白阳性细胞平均灰度明显减 少(P0 .05)。 模型组大鼠缺血侧脑组织与假手术组假手术侧比 较,TUNEL阳性血管内皮细胞数目显著增多,血浆ET一1含量明显 升高(P0.01)。MK一801组、NAC组、降纤酶组及三药合用组 分别与模型组比较,Tl入EL阳性血管内皮细胞数目明显减少, 血浆ET一1含量显著降低(P0.01)。三药合用组分别与MK一801 组、NAC组、降纤酶组比较,TUNEL阳性血管内皮细胞数目显 著减少,血浆ET一1含量显著降低(P0 .05)。 2.模型组缺血侧大脑皮质与假手术组假手术侧大脑皮质比 较,凋亡神经细胞数目明显增多(P0.01);小剂量甘露醇组、 大剂量甘露醇组、尼莫通组、甘露醇与尼莫通合用组凋亡神经 细胞数目均较模型组明显减少(P0.05),其中小剂量甘露醇组 与大剂量甘露醇组比较无显著差异(P.05),甘露醇与尼莫通 合用组分别与小剂量甘露醇组、大剂量甘露醇组、尼莫通组比 较凋亡神经细胞数目明显减少(P005)。 模型组缺血侧大脑皮质与假手术组假手术侧大脑皮质比较, 脑组织MDA及NO含量显著升高(P0.01);小剂量甘露醇组、 大剂量甘露醇组、尼莫通组、甘露醇与尼莫通合用组分别与模 型组比较,脑组织MDA及NO含量明显降低(P0 .05),其中 小剂量甘露醇组与大剂量甘露醇组比较无显著差异(P.05), 甘露醇与尼莫通合用组分别与小剂量甘露醇组、大剂量甘露醇 组、尼莫通组比较脑组织MDA及NO含量降低更显著(P0.05)。 第四军医大学博士学位论文 3.模型组与假手术组比较,脑组织MPO活性显著升高 (P0.01);川芍嗦组、黄茂组及两药合用组均可降低脑组织 MPO活性(P0.01),其中


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