表达谱芯片筛选子宫内膜异位症差异基因及鉴定

【摘要】：研究背景： 子宫内膜异位症(内异症，endometriosi EMS)为妇科常见多发疾病，指具有生长功能的子宫内膜组织出现在子宫腔被覆粘膜以外的身体其他部位。病因至今未明，我们期望从分子水平研究EMS的病因，寻找理想的分子标记，积极探索EMS的基因治疗，全面了解EMS在位和异位组织的差异基因。筛查相关差异基因，为在病因学方面有新的突破提供可靠的线索。基因芯片技术是近年来出现的分子生物学与微电子技术相结合的新型检测技术，目前已广泛应用于基因表达领域的研究。 第一部分 应用基因芯片筛选子宫内膜异位症相关差异基因 目的：应用表达谱芯片筛选EMS相关基因并对这些基因的功能进行初步分析。方法：本实验共选取6例患者进行研究，并经患者本人同意。术前均无激素用药史。所选患者均处于月经卵泡期，术中切去患者卵巢囊肿的囊壁，一半放入液氮，留作实验用，一半送病理科进行组织学诊断。同时刮取患者自身的在位内膜组织留用。用一步法抽提EMS患者在位和异位组织的RNA；将等量的实验组(异位组织)和对照组(在位组织)RNA逆转录合成荧光分子标记的cDNA做探针，混合后杂交上述芯片。严格洗片后用ScanArray3000扫描仪扫描芯片荧光信号图像，计算机分析比较两种组织中差异表达的基因。结果：在578点的芯片中，实验组与对照组存在差异 第四军医大学博士学位论文 表达基因。所检测的6例临床标本中共存在差异表达基因9条，其中上调2 条，下调7条。这9条基因分别是IL一12RBI，MEMD，ITGA6，CDg，CD73， RABZ，TNFsF13，ICAM一1和AR月I。并同时对差异表达基因进行了初步 生物信息学分析。结论:微矩阵基因芯片在筛选EMS发生的相关差异基因 方面有快速、高通量、高灵敏度等特点，EMS差异基因表达谱的分析为其 诊治提供了新的思路和线索。 第二部分内异症相关差异基因的鉴定 目的:对两条差异基因IcAM一1、A汕I进行初步鉴定，研究其在EMs 患者异位和在位内膜及非EMS患者在位内膜中的表达情况，分析其与 EMS的相关性。 方法: 1.收集EMS患者在位内膜组织18例，异位内膜组织23例，非EMS在 位内膜组织17例。所有收集的新鲜组织标本一经离体立即放入液氮， 留作提取RNA和蛋白质用。EMS在位内膜组为A组，异位内膜组为 B组，非EMS在位内膜组为C组。 2.利用Quantikine mRNA定量试剂盒对各组织中ICAM一1 mRNA的含 量进行定量检测。 3.利用Primer Primer 5 .0设计ICAM一1基因特异性引物，上游引物序列 为5’CAAGGTGACGCTGAATGG3’，下游引物序列为 5’TTATGACTGCGGCTGCTAC3’。pCR产物为464bp大小。应用天能 凝胶电泳成像系统软件分析PCR产物带，测定其吸光度值。 4.应用武汉博士德公司ICAM一1原位杂交试剂盒对A组(15例)、B组(18 例)和C组(巧例)的石蜡切片进行原位杂交研究。特异性探针为寡 核普酸探针，针对ICAM一1靶基因的序列为: a:5’一ACACT GCAGA CAGTG ACCAJ CTACA GCCTT一3”: b:5’一TCCCA GCAGA CTCCA户J，GTG CCAGG CTTGG一3’: e:5’一CCCAI，GAAAC CGAAC ACACAAGCCACGAAJ，一3’。 第四军医大学博士学位论文 5.ICAM一1的流式细胞仪鉴定，收集A组12例，B组10例，C组15例， 所取新鲜标本放入冰冷的PBS中立即送入实验室，进行原代细胞培养。 直接荧光标记的ICAM一1单抗标记细胞进行流式细胞仪检测。 6.ICAM一1的免疫组化鉴定，应用武汉博士德公司ICAM一1一抗和SABC 试剂盒对A组(25例)、B组(30例)和C组(25例)的石蜡切片进行 免疫组化研究。利用MPIAS一500多媒体彩色病理图文分析系统计算 各组织灰度值。 7.ICAM一1的认兔Stem一blot鉴定用ICAM一1抗体对各组织中ICAM一 lmRNA的含量进行半定量检测。应用天能凝胶电泳成像系统分析软 件计算各组织灰度值。 8.ELISA方法检测腹水中sICAM一1的含量共收集实验组(EMS患者) 腹水40例，I一11期20例，111一IV期20例，对照组(非EMS患者) 腹水40例。 9.利用Prime:Primer 5.0设计ARHI基因特异性引物，上游引物序列为 5，TeTGeee6eeeToe洲队T3’，下游引物序列为5’ TToeeoTeGeeAeTe竹c3’。PeR产物为237bp大小。应用天能凝胶 电泳成像系统分析软件分析PCR产物带，测定其吸光度值。 10.根据ARHI基因碱基序列设计特异性DNA探针，交由鼎国生物技术公 司合成。ARHI探针序列为: 5’AGCTT TGGCT CCAAG GAACA GAAGC TGCTG AAGCG GTTGC GGCTT CTGCC3’ 结果: 1.所有来自EMS患者和非EMS患者的标本均经过病理学检查确诊，样 本抽提的总RNA经分光光度计和电泳质检完全合格。 2.用SPSS 10.0软件进行统计学处理分析各组中ICAM一lmRNA水平发 现，A组与B组之间比较有显著差异(尸0.05);A组与C组之间比 较，虽然C组平均值高于A组，但是两者没有显著性差异(尸0.05); B组与C组之间也具显著性差异(尸0.05)。 3.ICAM一1R’1’- PCR半定量结果发现，A组与B组之间有显著差异(尸 0.05);A组与C组之间，虽然C组的平均值高于A组，但是两者没 第四军医大学博士学位论文 有显著性差异