自体骨髓间充质细胞心肌内移植治疗急性心肌梗死的实验研究

【摘要】：实验背景和研究目的 心肌梗死的直接后果是心肌坏死。由于残存的心肌细胞无法重建坏死组织，一般情况下梗死后心脏的功能进行性恶化。尽管心脏移植是晚期心脏疾病理想的治疗手段，但是供体匮乏等原因使得这一技术难以普及。于是人们积极探索其他可能的治疗手段。自体细胞移植是一种很有希望的生物疗法。骨髓间充质细胞(MSCs)具有保持未分化特性无限增殖的能力，并且能够分化为包括心肌细胞在内的各种类型的细胞。与其他类型用于移植的细胞相比，MSCs能够从成年人自身获得，因而不会引起伦理学问题或组织排斥反应。目前，自体MSCs心肌内移植已经成为恢复心肌梗死后组织活力潜在的治疗手段。 本研究旨在探讨心肌梗死后自体MSCs心肌内移植引起心肌再生并 第四军医大学博士学位论文 .....甲.......... 减轻心功能不全的可能性，同时明确体外诱导及注射部位等因素对移植 效果的影响，另外进行一系列的体外实验旨在评价MSCs用于心肌梗死后 心肌内移植治疗的潜在价值。 方法和结果 体外部分密度梯度离心法分离Mscs，体外贴壁培养扩增。流式 细胞仪分析表明此种方法培养的MSCs表面抗原CD34表达阴性，CD44表 达阳性的细胞均在95%以上。MSCs在体外能够快速增殖大量扩增，在培 养基中添加5一澳脱氧尿喻睫核昔酸仍rdU)孵育24h后，超过90%的MScs 被BulU有效标记。通过不同浓度的5一氮杂胞昔(5一姗)诱导24h后，继续 培养3w，免疫细胞化学、westem blot、透射电镜等手段均证实部分 MSCs 已初步向肌细胞分化。通过将MSCs用BrdU标记后与乳鼠心肌细胞直接接 触式共同培养，3w后大多数B川U标记胞核阳性的MScs免疫细胞化学染 色呈现胞浆横纹肌a一actin阳性。透射电镜下可观察到共培养体系内退化 的心肌细胞和向肌细胞分化的MSCs.但是在另一共培养体系内，与心肌 细胞分层培养的MSCs并未表现出向肌细胞分化的趋势。另外，对培养的 MScs采用脂质体包裹的方法转染重组质粒peDNA3.1一vEGF16，，免疫细胞 化学染色及图像分析系统证实转染后的细胞VEGFI“的表达明显增加。 体内部分34只新西兰白兔均经过骨穿抽取骨髓，开胸建立心梗 模型，MSCs体外培养及二次开胸心肌内注射等操作，按照对其MSCs 的处理方式和心肌内注射的成分不同随机分为3组:A组12只，其MSCs 未经体外诱导:B组12只，其MSCs经5-aza体外诱导;C组10只，其 MSCs只进行体外实验研究。A、B两组注射自体细胞的悬液，C组列为 对照组，注射生理盐水。根据注射位置不同进一步将A、B两组细分为 A~和Am，n，Bscar和B~。两个亚组(每个亚组各6只实验动物)。纳入 第四军医大学博士学位论文 分组的对象排除了建模、骨穿、细胞培养、心肌内注射等任一环节失败 的实验动物。建立兔的急性心肌梗死模型，同时穿刺抽取骨髓分离培养 Zw左右。移植前MSCs培养墓中添加BrdU孵育24h。随后二次开胸心 肌内注射细胞或生理盐水。建立梗死前、开胸注射前和注射后lmon超声 检测左心室(LV)功能。注射后lmon取心脏组织行光镜及电镜检查。与C 组相比，心肌内注射细胞后lmon时A、B两组LV功能显著改善。A、B 两组之间无显著性差异。亚组分析表明细胞注射的部位是造成心梗后LV 功能差异的原因。最后组织学检查证实各组梗死区组织学特点无明显差 异，为疤痕组织增生的典型表现。BrdU标记阳性的细胞分布范围与细胞 注射范围基本一致。其中，介于正常心肌和梗死心肌之间的“边缘区” 可见以BrdU标记阳性的肌细胞为特点的心肌再生，透射电镜下可见梗死 边缘区变性的心肌细胞和向肌细胞分化的MSCs。 结论 MSCs易于分离、纯化和大量扩增，采用BrdU标记简便高效。体外 采用5一aza诱导或与心肌细胞直接接触共同培养，均有部分MSCs向肌细 胞分化。采用脂质体包裹重组质粒PcDNA3.1一vEGFI65可成功转染Mscs， 转染后MSCs的VEGF表达一过性增高.体内研究表明，与未诱导的MSCs 相比，5一aza诱导的MSCs移植并未表现出更多的优越性。MSCs注射的 部位是心功能改善关键的影响因素。如果注射到疤痕区，MSCs更倾向于 分化为成纤维细胞。如果注射到边缘区，MSCs则在存活心肌细胞的直接 接触下倾向于分化为肌细胞.这与前述体外共培养实验得出的结论相同， 即MSCs向心肌细胞转化需要与心肌细胞的直接接触。因此，在进行MSCs 心肌内移植时不仅要强调将MSCs投送到梗死区，更要注意将MSCs投 送到尚有存活心肌的边缘区。