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牛牙骨质附着蛋白基因克隆的初步研究及其对体外培养人牙囊细胞的生物学作用

吕昕  
【摘要】:牙骨质是一种高度反应性矿化组织,它是牙周膜纤维附着、使牙齿稳定于牙槽窝内、承受和传递合力的重要生理结构。根尖周组织病和牙周疾病一般均有不同程度的牙骨质破坏。根尖周组织病变的修复包括炎症的控制或消除及根尖周骨、牙周膜和牙骨质的重建。牙周组织的再生修复中需要新的结缔组织和牙槽骨的形成,更重要的是需要结缔组织在牙根表面上的再附着,而牙骨质正是结缔组织附着在牙根表面的重要结构。近年来的研究说明牙骨质附着蛋白(cementum attachment protein,CAP)在牙骨质的改建、沉积,形成牙周膜在牙根表面的附丽这一过程中发挥了重要作用。目前对CAP的研究主要集中在其对牙周膜细胞、牙龈成纤维细胞、牙槽骨细胞等的黏附、伸展及有丝分裂活性的影响。本研究探讨提取纯化CAP的简便方法并对所获得的牛CAP进行生物活性鉴定;采用Edman法对所获得的牛CAP进行N末端氨基酸序列测定,根据测得的N末端15个氨基酸序列合成简并引物,运用RT-PCR和简并PCR的方法对牛CAP cDNA信息进行了初步研究,为CAP的重组表达提供一定的理论依据。同时利用所获 第四军医人学博_卜学位论文 得的蛋白研究了CAP对体外培养人牙囊细胞(human dental rolliele eells,HoFe)的生物学作用,加深了对eAP的了解。本研 究为今后进一步研究CAP结构和功能奠定了一定基础,也为根尖 周组织病和牙周疾病的治疗、牙种植体的表面改良、牙齿再植等 探索新的方法。本研究分为以下3个部分: 一、牛牙骨质附着蛋白的提取纯化与鉴定 拔除2龄牛健康牙齿,清除根面结缔组织,刮下牙骨质,采 用醋酸、盐酸肌抽提法获取牛牙骨质基质提取物,经过透析和超 滤离心后,行两种提取物的SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳(sodium dodeeyl sulfate一Polyacrylamide gel eleetrohoresis,SDS一PAGE),切 取盐酸孤提取物经SDS一PAGE后Mr55,000的蛋白质条带,利用 异丙醇洗脱蛋白质,并采用三氯醋酸加丙酮沉淀法浓缩蛋白质, 冻干后获得牛CAP。经过SDS一PAGE和等电聚焦电泳初步鉴定纯 度,均得到单一条带,并发现所获得的牛CAP等电点介于 7 .35一8.15。 为了进一步分析所获得的牛CAP,对其进行了肤质量指纹图 谱测定及数据库检索,测得CAP分子量为Mr55,261,纯度大于 95%,且未发现CAP与任何一种PSI蛋白质数据库中的蛋白质完 全匹配。 采用MTT比色法和固相结合分析实验测定了所获得的牛 CAp对人牙周膜细胞(human periodontal ligaments eells,HpDLe) 勃附性的影响,发现CAP能明显促进HPDLC的附着,CAP的促 砧附活性并不是随着其浓度的增加而增加的。在1.0一2.smg/L浓 度时促豁附作用为最强,当浓度在2.smg/L时,其促薪附效果最 佳,浓度在5.omg/L时,促勤附效果反而有所下降。这些数据与 以往学者的研究结果相符,表明所提取纯化的牛CAP具有生物学 活性。 二、牛牙骨质附着蛋白的N末端氨基酸序列分析与基因克隆的初 第四军医人学博士学位论文 步研究。 经过Edman法测定牛CAP的N末端巧个氨基酸残基为:ne (异亮氨酸,I)、pro(脯氨酸,p)、Leu(亮氨酸,L)、Asp(天 冬氨酸,D)、Pro(脯氨酸,P)、Val(撷氨酸,V)、Ala(丙氨 酸,A)、Gly(甘氨酸,G)、Cys(半肤氨酸,e)、Lys(赖氨酸, K)、Glu(谷氨酸,E)、Pro(脯氨酸,P)、Ala(丙氨酸,A)、 Afa(丙氨酸,A)、AsP(天冬氨酸,D)。 利用测得的牛CAP的N末端巧个氨基酸残基序列,设计合 成简并引物,提取牛牙骨质总RNA,用Oligo(dt)作引物逆转录 合成牛牙骨质cDNA,以牛牙骨质cDNA为模板,利用简并PCR 技术进行牛CAP cDNA扩增,PCR产物经1%琼脂搪凝胶电泳得 到大小约400bp、SO0bp、600 bp、750 bp、goobp的条带,初步 为牛CAP的克隆表达奠定基础。 三、牛牙骨质附着蛋白对体外培养人牙囊细胞的生物学作用 为了解该蛋白在牙根发育过程中的作用,采用MTT比色法 和固相结合分析实验观察了体外培养人牙囊细胞(h uman dental folliele cells,HDFC)在牛CAp包被表面上的附着和伸展情况,发 现CAP能明显促进体外培养的HDFC在其包被表面上的附着, 最佳促豁附作用的浓度为2.smg/L,但其对HDFC伸展无促进作 用。 采用MTT比色法观察了CAP对HDFC增殖的影响,结果发 现CAP对体外培养HDFC的增殖无促进作用。酶动力学方法观 察了eAP对HnFe碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALp)活性的 影响。研究结果表明,CAP在低浓度时不影响HDFC的ALP活 性;而在高浓度,可增强其ALP活性。 采用RT一PCR技术首次证明CAP对HDFC内源性骨涎蛋白 (bone sialoprotein,Bsp)基因表达的影响具有剂量效应和时间效 应。提取不同cAP作用浓度及时间的HDFc总RNA,用oligo(dt) 第四军医人学博士学位论文 作引物逆转录合成HDFC cDNA,以此为模板,用设计的BSP成 熟肤引物进行PCR扩增。将扩增的BSP基因片段从1%琼脂糖凝 胶中ha]收,插入pMn 18一T Veetor克隆载体,转化大肠杆菌DH5a, 挑选阳性克隆,提取质粒DNA,通过限制性酶切进行鉴定并进行 核普酸序列测定。结果表明:克隆到人BSP成熟肤基因片段,序 列与GenBank中收录的从人骨细胞cDNA文库中克隆的BSP基


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