Survivin在非霍奇金淋巴瘤中的表达及其反义寡核苷酸对淋巴瘤细胞增殖与凋亡的影响

【摘要】：非霍奇金淋巴瘤(NHL)大约占淋巴瘤总数的80％～90％，是淋巴瘤最常见的类型。NHL通常采用化疗和放疗，尽管化放疗效果较好，但原发耐药和反复复发往往成为此类患者死亡的主要原因。另一方面，由于化疗直接针对快速生长的细胞，易导致上皮细胞(如胃肠道上皮细胞)死亡或影响造血干细胞造成血细胞减少，这些副作用不仅降低了肿瘤患者的生活质量，而且限制了用药强度，最终导致肿瘤细胞耐受治疗。因此，有必要寻找有利于长生存的治疗方法，通过激活死亡信号途径和抑制淋巴瘤细胞赖以生存的关键分子也许是一种策略，而其中应用分子方法如反义寡核甘酸是达到这种目的的方法之一。 不少实验研究表明，凋亡失控在肿瘤发生发展中起重要作用。对肿瘤而言，凋亡减少引起细胞寿命延长，利于基因突变的产生，导致肿瘤细胞能够逃逸化疗药物或放射治疗所诱发的死亡并促进肿瘤转移。因而，调控凋亡对保护组织的完整性及消除肿瘤细胞有重要意义，是肿瘤治疗的新策略。IAPs(inhibitor of apoptosis protein, IAP)分子是广泛表达的凋亡抑制蛋白家族。Survivin是IAP家族新成员，是最近通过效应蛋白酶受体—1(effector cell protease receptor-1,EPR-1)cDNA在人类基因组库的杂交筛选中分离出来IAP分子之一。Survivin的表达具有细胞周期依赖性，在细胞周期的G_2／M期表达，在有丝分裂过程中与纺锤体的微管蛋白相连。在结构上，Survivin与IAP家族其它成员不同，Survivin只含有一个BIR(baculovirus IAP repeat)序列，没有锌指结构。在表达方式上，与Bcl-2及IAP家族其它成员不同的是，Survivin选择性表达于几乎所有肿瘤组 第四军医大学博士学位论文 织，而在正常成人组织不表达。事实上，无论其胚胎起源、分化和组织 学类型有何不同，Survivin表达于迄今为止所检查过的所有肿瘤组织。 这种不同的表达方式具有重要的实际应用价值。研究表明，Survi vin表 达可抑制各种凋亡诱导因子诱发的细胞凋亡，其抑制凋亡机制与另一重 要的凋亡抑制因子Bcl一2不同。Survivin直接抑制Caspase蛋白酶，并 对起始和终末Caspase分子均有抑制作用。Survivin能够通过抑制 Caspase一3，7和9而抑制凋亡，这一过程发生在B。1一2抑制线粒体细胞 色素C释放从而抑制凋亡作用的下游。目前认为S盯vivin在肿瘤的发生 中有重要作用，其作用机制主要与抑制凋亡、促进细胞生长、促进肿瘤 血管形成有关。预后方面，S盯vivin表达与疾病进展、体内细胞凋亡减 少、肿瘤播散增加、复发、最终导致生存期缩短等不良预后因素密切相 关。治疗方面，体内和体外研究表明，靶向S盯vivin的反义技术及其突 变体能够诱导凋亡，抑制肿瘤细胞生长并增加细胞对化疗药物和放疗的 敏感性。上述研究表明，S盯vivin是有用的肿瘤生物学指标。S盯vivin 可能作为肿瘤诊断新靶标，另一方面，由于其选择性表达于肿瘤组织而 在正常组织不表达的特点，可望成为针对凋亡机制的靶向治疗的新靶标。 对凋亡相关基因表达的了解，有助于更好地理解肿瘤生物学意义， 帮助确定肿瘤临床状况和筛选新的靶向治疗分子。研究表明，CaSPase一3 和p53表达异常对多种肿瘤恶性增殖有重要作用，但在NHL中有关二者 的表达与Survivin之间的关系尚不清楚。Caspase一3是半跳氨酸蛋白酶， 属白介素1一beta一转化酶家族(ICE)，为凋亡效应分子。Caspase一3在 NHL中表达已研究，但其结果差异很大，最近研究表明，Caspase一3表达 水平与定位在NHL肿瘤进展过程中可能有重要作用。p53是介导凋亡与肿 瘤发生的重要因子，最近研究表明野生型p53基因能够抑制S盯vivin基 因启动子的活性而对S盯vivin表达起负调控作用。Ki一67表达于所有非 G。的增殖期细胞，由于其在肿瘤组织中的表达能够反应细胞增殖活性，在 肿瘤研究中倍受关注。 为研究Survivin基因在NHL肿瘤发生中的作用，我们检测了 Survivin在54例NHL及10例反应性增生淋巴结石蜡包埋组织中的表达。 为进一步了解Survivin在细胞凋亡和增殖中的作用，我们应用免疫组化 法检测了Caspase一3、p53和增殖相关抗原Ki一67的表达，并对它们与 第四军医大学博士学位论文 Sury 1 vin表达之间的关系进行了探讨。在此基础上，还检测了淋巴瘤细 胞株Jtlrkat和Raji中Survivin mRNA和蛋白水平的表达情况。为深入研 究Survivin在NHL发病中的作用及探讨以Survivin为靶标应用其反义 寡核甘酸治疗NHL的可行性，我们观察了反义Survivin寡核甘酸对淋巴 瘤细胞株凋亡和药物敏感性的影响。主要实验方法和结果如下: 1 .Survivin在反应性增生淋巴结组织及NHL组织中的表达:应用免 疫组化Envision法对石蜡组织标本Survivin，Caspase一3，p53 and ki一67 表达进行检测。Survivin在肿瘤细胞细胞浆表达，呈弥漫性分布。 Survivin在54例NHL中的总表达率为51.9%(28/54)，相反在反应性增生 淋巴结组织中未检测到Survi vin表达或其表达信号极弱。Survivin在低 度恶性组NHL中的表达低于中一高度恶性组，分别为19%(4/21)、 72.7%(24/33)，两组之间差异显著(只0.001)。提示Survivin可