新型纳米微囊复合体介导大鼠肝靶向基因转染体外及体内的实验研究

【摘要】：肝脏是基因治疗应用中主要的靶向器官，因为它是许多代谢性疾病的靶点，肝脏的转基因产物容易进入血液循环，而且由于它的显微解剖结构，也是实现肝靶向基因转移的重要特性之一。肝血窦内皮系统占肝表面正弦间隙的6％-8％，这些间隙及微小胆管可以允许生物大分子及纳米载体直接转移至肝细胞。 静脉注射裸DNA，显示肝脏绝大部分特异性内吞，但却无任何转基因表达水平，只有通过流体动力学／高流速注射的方法才能达到高表达水平，注射体积占体重的8％左右，由于不符合生理条件，故不能应用于临床。然而减小注射压力及液体量，却无基因表达水平。载体能够有效保护血清降解DNA，促进肝脏的特异性转运，与肝细胞特异结合，明显提高转基因表达水平，但是目前非病毒载体的最大障碍，就是转基因水平低且瞬时。 病毒载体系统中的逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相 第四军医大学博士学位论文 关病毒载体等，其基因传递效率高，体内可以感染多种细胞， 故可以通过门静脉或原位注射的方法，但其仍存在许多难以 克服的局限性，如，逆转录病毒不能感染非分裂细胞;腺病毒 不能稳定整合于宿主细胞基因组内，故难以长期稳定表达，甚 至可能引起机体强烈的免疫反应;腺相关病毒载体容量小，难 以为大片段基因所利用，且制备困难。 非病毒载体基因转移技术，是另一种较为安全的方法。 1998年Le。ng等人建立了纳米微囊(Nanosphere)包裹非病 毒载体基因转移技术。纳米微囊直径80一30Onm;无免疫源性， 包裹转载物可避免其在受体内被溶酶体酶降解，同时可包裹 多个转导基因，提高了转染效率;由于采用可降解生物材料 包裹，故明显提高转载基因的活性并具有长时间缓释功能， 并可在保持基因活性情况下低温长时间保存。 对于原位转基因，基因载体未结合配体，也可以有较高 的转基因表达的水平，通过门静脉基因转移，大部分被 kupffer细胞特异性内吞，因此肝脏表达水平最高，但肺及脾 内也有部分转基因表达的水平，但表达水平仍相对较低且瞬 时，但通过胆管基因转移，为肝靶向基因转移提供了平台， 且仅限于肝实质细胞。 因此本实验设计纳米微囊一报告基因复合体，体内外转染 大鼠肝细胞，探索其应用于临床肝靶向基因治疗可行性。本 试验分别利用纳米微囊(Nanosphere)包裹Lueiferase报告 基因，作为基因治疗的肝靶向载体，以提高肝靶向载体的表达 效价，并对合成的载体进行了体内外的初步生物评价。 目的:探讨纳米微囊载体应用于大鼠体外及体内基因治疗的 可行性，安全性、转基因表达水平、转染效率、转移方法并 与质粒DNA进行比较。方法:以荧光素酶 第四军医大学博士学位论文 (lueiferase，VR1255)、绿色荧光蛋白(EGFP)为目的基因， 分别利用纳米微囊PEI(聚己烯亚胺)，Chitosan(壳聚糖) 自组装成纳米微囊复合体，检测其物理化学特性，体外转染 肝癌细胞系HepGZ，Hep3B，Huh一7及原代大鼠肝细胞 (Hepatoeyte)，Kupffer细胞，内皮细胞，转染45小时后检 测细胞转基因表达水平，流式细胞仪检测绿色荧光蛋白表达 转染效率，MTT法检测对转基因细胞的毒性。体内通过门静脉、 胆管及尾静脉灌注，检测3、7、14天大鼠肝脏转基因表达水 平，不同肝叶转基因表达分布，不同组织器官的转基因表达 水平;肝功能检测纳米微囊复合体对肝细胞的毒性;流式细 胞仪检测体内转染效率;胆管灌注纳米微囊包裹Cys标记的 质粒DNA，通过共聚焦显微镜观察纳米微囊复合体在体内的分 布，及细胞特异性内吞，PCR及RT一PCR，检测一月后的转基 因大鼠DNA及RNA的表达水平。应用特异性KC清除剂如脂质 体包裹的二氯亚甲基二磷酸盐及氯化礼(gadolinium ehloride，GdC13)选择性去除Kupffer细胞，胆管灌注转基因， 检测3、7、14天大鼠肝脏转基因表达水平，不同肝叶转基因 表达分布，不同组织器官的转基因表达水平。结果:纳米微 囊载体DNA复合物大小约为1 00~220n。，表面电荷十22.6mV， 而DNA包裹率为99%o在大鼠血清及胆汁中比较质粒DNA具有 较好的稳定性，PEI一DNA复合物较Chitosan一DNA复合物抗降 解能力强。体外转染证明:多种细胞系及原代细胞转基因表 达水平PE工一DNA约为Chitosan一DNA的10倍，体内:在三种 转基因方法中，胆管灌注组是最优的选择，同组比较 Chitosan一DNA3天的转基因表达水平高于PEI一DNA的17倍， 是背景的500倍，其它主要器官未发现有明显转基因表达水 平;流式细胞仪显示Chi tosan一DNA转染效率为4.8%士 第四军医大学博士学位论文 1.2，PEI一DNA为1.8%士0.9，免疫荧光显示纳米微囊载体DNA 复合物围绕汇管区分布，共聚焦显微镜显示肝细胞特异性内 吞纳米微囊，仅有少数Kupffer细胞内吞PEI一DNA，PcR及 RT一PCR显示PEI一DNA、Chitosan一DNA肝组织中DNA表达水平 至少可维持4周，而同一时间点却无mRNA表达水平。选择性 去除Kupffer细胞，PEI一DNA组转基因表达水平增加了14510 倍，Chitosan一DNA组转基因表达水平增加了100倍，质粒DNA 增加了2020倍，转基因表达水平3天时为PEI一DNA Chitosan一DNA质粒DNA。结论:我们的研究表明:纳米微 囊肝靶向的基因表达可