人lrg基因的表达分布及功能的初步分析

【摘要】：脂多糖(LPS)与某些炎症的发生密切相关。宿主细胞识别LPS主要依靠细胞膜上的模式识别受体(PRR)。PRR是启动LPS反应的首要环节。现已发现多种膜蛋白参与清除LPS或激活细胞的作用。LPS信号传导途径非常复杂，多个PRR通过多条途径传递信号，单凭现有的信号传导分子很难解释其中的一些通路。研究LPS的致病机理，迫切需要寻找新的信号传导分子。 为此，课题组致力于探讨LPS刺激后应答基因的功能，尤其是一些新发现基因的功能。lrg是一种LPS应答基因。系本课题组柴玉波博士采用基于PCR的改良消减杂交技术，构建LPS刺激后人牙髓细胞差异表达基因文库，从中筛选出的新基因，GenBank录入号为AF143740等。 在国家自然科学基金(No．30170361)的资助下，课题组对人lrg基因的功能展开了一系列研究，获得了初步结果。 本实验重新克隆了人lrg基因、测序证明无误；并对人lrg基因的功能作了生物信息学的初步分析。生物信息学分析表明，人 第四军医大学博士学位论文 lrg基因的开放读框为558bp，编码蛋白质包含186个氨基酸;编 码序列中包含2个相互重叠的亮氨酸拉链结构和1个螺旋一转角- 螺旋结构，而亮氨酸拉链结构是DNA结合蛋白的特征性结构。因 此，对人lrg基因的研究既有线索可寻，又可以采用一些较新的方 法，来加快研究进度。 本研究工作中，首先在原核表达系统中表达人lrg基因编码 的蛋白质。采用PCR扩增人lrg cDNA编码区，克隆入表达载体 PcTAT中，构建成融合6His的表达载体PcTAT一lrg，转化E.coli BLZI(DE3)，以IPTG诱导表达。表达出相对分子质量(Mr)约 25 000的蛋白，占菌体总蛋白的51%。表达产物为可溶性的，用 Ni一NTA亲和层析柱纯化的表达蛋白达到电泳纯。 随后制备鉴定了人Lrg免疫血清。采用纯化后6His一TAT一hLrg 蛋白作为免疫抗原，对新西兰大白兔实施多次免疫;获得了兔抗 人Lrg免疫血清。经过ELISA和westem Blot检测，效价在1: 1000以上。制备得到兔抗人Lrg免疫血清，为lrg的功能研究打 下基础。 随之对人lrg的表达分布规律进行了探索。1.人Lrg蛋白的 表达分布规律:用制备的兔抗人Lrg免疫血清对几种正常胎儿组 织进行免疫组织化学染色，结果表明人Lrg蛋白分布于绝大多数 所检测的组织，表达由强到弱依次为:胃、翠丸、食道、小肠、 肝、肾、心、肺等:2.人lrg一mRNA的表达分布规律:以人lrg 基因为探针，用Roche公司的原位杂交试剂盒进行杂交检测，结 果表明人Irg一mRNA在翠丸、小肠等组织内有相当高的表达。 为分析人Lrg蛋白在真核细胞内的亚细胞定位，构建了人Lrg 与绿色荧光蛋白融合的真核表达载体PIRESZ一EGFP一Lrg，瞬时转 染NIH3T3细胞，发现带荧光的融合蛋白主要位于胞浆中;进一 步用兔抗人Lrg免疫血清对培养的牙乳头细胞进行间接免疫荧光 分析，结果同样表明人Lrg的细胞内定位以胞浆为主。 第四军医大学博士李位论久 人lrg基因究竟对肝癌细胞系HepGZ有何影响?为解决上述 问题，构建了人lrg基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)一zrg，并稳 定转染到肝癌细胞系HepGZ。westem Blot和间接免疫荧光法等实 验表明人lrg基因己经成功转染。透射电镜的研究发现稳定过表 达人lrg基因的HepGZ细胞发生微绒毛的减少，说明过量表达的 人Lrg蛋白抑制了HepGZ细胞的生长;流式细胞仪检测表明稳定 过表达人lrg基因的HepGZ细胞产生细胞Gl期的阻滞，说明过量 表达的人Lrg蛋白抑制了HepGZ细胞的增殖。 为深入研究人lrg基因的功能，课题组设计了人lrg基因的突 变引物，利用PCR法将亮氨酸拉链的第二个Leu突变为Ser(从 273匕p起cggtta突变为agatct)，构建了人lrg基因的定点突变 体。将带突变型人11.9的真核表达载体转染肝癌细胞系HePGZ， 经G418筛选得到稳定表达的细胞株。透射电镜显示实验组细胞出 现微绒毛减少、溶酶体增加，直至出现凋亡特征一细胞核固缩、边 移;同时流式细胞仪检测到凋亡峰。说明定点突变的人lrg基因 通过其编码的蛋白质对肝癌细胞系HePGZ产生促凋亡作用。 RN Ai是当今分子生物学领域最引人注目的技术之一。目前 RNAi技术在哺乳动物细胞中也得到了广泛的应用。本课题运用 RNAi技术对人lrg基因开展了初步研究。课题组针对人lrg基因 设计了RNA干涉核普酸片段，并克隆到5 hRNA表达载体pAVU6十27 中。将pAVU6+27一hlrg稳定转染入HepGZ一peDNA3.l价)一lrg细胞， RT一PCR检测结果表明，对人lrg实施RNA干涉的实验组细胞人lrg mRNA明显降解;western Blot表明RNA干涉后Lrg蛋白水平下 降;用兔抗人Lrg免疫血清进行的间接免疫荧光法显示，RNA干 涉后的细胞胞浆内的绿色荧光比对照组明显减弱。以上实验表明 RNA干涉是成功的。进一步的研究发现:从形态上讲，对人lrg 实施RNA干涉的实验组细胞多呈条索状生长，细胞突起增加，侵 第四军医大学博士李位论失 袭性增强:从细胞周期上讲，对人lrg实施RNA干涉的实验组 细胞Gl期明显缩短、GZ期延长，表明细胞的分裂前期增加，增 殖作用增强。 综上所述，课题组认为: 1稳定过表达的人Lrg可产生HePGZ细胞Gl期阻滞;RNA 干涉之后阻滞作用明显减弱。表明人Lrg可能是