Survivin基因对人肝癌细胞增殖和凋亡作用机制的研究
【摘要】:原发性肝细胞肝癌(HCC)是世界范围内流行率和死亡率都很高的恶性肿瘤之一,与世界其他国家相比,我国HCC死亡率居各国之首,但是肝癌的治疗一直是一个棘手的问题。目前肝癌治疗的主要手段是手术切除,但手术切除只适用于部分早期患者,而且手术后的高复发率影响最终的疗效。由此可见,对HCC发病机制和治疗手段的研究是当务之急。
Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的一个新成员,它主要表达于发育中的胚胎组织以及人类常见的恶性肿瘤组织,而不见于终末分化的成熟组织。研究发现,Survivin对细胞凋亡和细胞分裂周期有双重调控作用:Survivin直接作用于caspase,主要抑制凋亡终末效应器caspase-3和caspase-7的活性或干扰caspase-9的活性,阻断各种刺激诱导的下游细胞凋亡的共同通路;Survivin特异性地在细胞周期G2/M期表达,通过与细胞有丝分裂纺垂体的微管结合,参与对细胞基因的转录调控;Survivin可以直接抑制caspase-3活性以降低肿瘤细胞对许多化疗药物的敏感性。由于Survivin选择性的组织细胞分布特征以及抑制细胞凋亡特殊的作用机理,可能成为肿瘤诊断的标志物以及肿瘤基因治疗的新靶点。
研究证明,HCC的发生发展涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活过程,有针对性地选择在HCC发生发展过程中发挥重要作
第四军医大学博士学位论文
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用的癌基因或抑癌基因,利用反义寡核昔酸技术、基因剔除、基
因替代以及基因转导等技术,抑制或敲除癌基因的表达,以期达
到基因治疗HCC的目的。
肿瘤凋亡抑制基因靶向治疗的优点是可以促进肿瘤细胞凋亡
并抑制其增殖,而对正常组织几乎没有不良影响。RNA干涉(RNA
int。rference,RNAi)能够特异、有效地降解mRNA,引起转录后水
平的基因沉默,在小鼠和人的体外培养细胞中成功阻断了基因的
表达,实现了细胞水平的基因敲除。利用RNAi技术能否在体内、
体外成功敲除人肝癌细胞中Survivin基因的表达,诱导肝癌细胞
凋亡、抑制肝癌细胞增殖是本实验的主要内容。
研究目的:探讨Survivin基因在人肝癌细胞增殖和细胞凋亡
中的作用机制,为人肝癌的基因治疗提供理论依据。
实验方法:
1、应用SABC免疫组织化学染色、RT一pCR和western b10t
等技术对87例HCC及其50例癌旁肝组织石蜡标本、8例HCC组织
和4种人肝癌细胞系(HepGZ、SMMC一7721、HHCC、HCC一9724)中
Survivin、P53、Bel一2蛋白和Survivin mRNA以及细胞凋亡进行
检测。
2、通过脂质体介导将Survivin基因转染人肝癌细胞系HopGZ
中,建立稳定表达survivin基因的HepGZ细胞模型(S竹一HepGZ)
;运用SABC免疫组织化学染色、RT一PCR、流式细胞分析(FCM)
以及生长曲线等检测转染前后HepGZ中Survivin蛋白及其mRNA
的表达、细胞周期和细胞生长的变化。
3、通过脂质体介导将Survivin基因的dsRNAi真核表达载体
转染人肝癌细胞系SMMC一7721,建立dsRNAi的SMMC一7721细胞模
型(S一RNAi一7721);运用SABC免疫组织化学染色、RT一PCR、Western
blot、FCM分析、TUNEL技术、透射电镜、DNA Ladder分析以及生
长曲线等检测转染前后S翩C一7721中Survivin蛋白及其mRNA的
表达、细胞周期和细胞凋亡、细胞增殖以及细胞生长的变化。
4、以BALB/c裸鼠为研究对象,采用皮下注射H即G2、
Svv一HepGZ和S枷C一7721、S一刚Ai一7721细胞悬液,建立肝癌细胞
第四军医大学博士学位论文
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的裸鼠动物模型;通过测量和称重等方法观察肿瘤形成和肿瘤的
生长状况;采用SABC免疫组织化学染色和RT一PCR检测肿瘤组织
Survivin蛋白及其mRNA的表达。
5、应用Western blot、 TUNEL技术、DNA Ladder分析和FCM
分析等检测抗肿瘤药物表阿霉素在相同浓度(10 pg/ml)不同时
间作用于HepGZ、SVV一HepGZ和SMMC一7721、S一RNAi一7721细胞后,
Sury ivin蛋白及其mRNA的表达以及细胞周期和细胞凋亡的变化。
实验结果:
1 .Survivin基因在HCC组织和人类肝癌细胞系表达上调,其
表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、有否转移、Bd一2的表达、组
织分化程度及临床分期等均无相关关系,而与突变型P53的表达
密切相关。
2.转染Survivin基因的HepGZ细胞出现了Survivin蛋白及
其mRNA的表达,成功建立了稳定表达Survivin基因的HepGZ细
胞模型,该细胞模型表现出明显的增殖活性。
3.转染Survivin基因dsRNAi的S枷C一7721细胞,Survivin
蛋白及其mRNA表达消失,成功建立了稳定表达S盯vivin基因
dsRNAi的SMMC一7721细胞模型,该细胞模型表现为Survivin基因
在蛋白水平和转录水平表达受阻,出现细胞凋亡的典型特征,细
胞生长明显受抑。
4.转