Survivin基因对人肝癌细胞增殖和凋亡作用机制的研究

【摘要】：原发性肝细胞肝癌(HCC)是世界范围内流行率和死亡率都很高的恶性肿瘤之一，与世界其他国家相比，我国HCC死亡率居各国之首，但是肝癌的治疗一直是一个棘手的问题。目前肝癌治疗的主要手段是手术切除，但手术切除只适用于部分早期患者，而且手术后的高复发率影响最终的疗效。由此可见，对HCC发病机制和治疗手段的研究是当务之急。 Survivin是近年发现的细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族的一个新成员，它主要表达于发育中的胚胎组织以及人类常见的恶性肿瘤组织，而不见于终末分化的成熟组织。研究发现，Survivin对细胞凋亡和细胞分裂周期有双重调控作用：Survivin直接作用于caspase，主要抑制凋亡终末效应器caspase-3和caspase-7的活性或干扰caspase-9的活性，阻断各种刺激诱导的下游细胞凋亡的共同通路；Survivin特异性地在细胞周期G2／M期表达，通过与细胞有丝分裂纺垂体的微管结合，参与对细胞基因的转录调控；Survivin可以直接抑制caspase-3活性以降低肿瘤细胞对许多化疗药物的敏感性。由于Survivin选择性的组织细胞分布特征以及抑制细胞凋亡特殊的作用机理，可能成为肿瘤诊断的标志物以及肿瘤基因治疗的新靶点。 研究证明，HCC的发生发展涉及多种癌基因的激活和抑癌基因的失活过程，有针对性地选择在HCC发生发展过程中发挥重要作 第四军医大学博士学位论文 .亩亩..亩....口目西面.百面面面面面.面画口口.画.面面面面面面面面面面面面面面面百.面面面百面面面面口肠亩.亩百.口...口...亩百日亩亩亩百百亩亩亩百亩亩草 用的癌基因或抑癌基因，利用反义寡核昔酸技术、基因剔除、基 因替代以及基因转导等技术，抑制或敲除癌基因的表达，以期达 到基因治疗HCC的目的。 肿瘤凋亡抑制基因靶向治疗的优点是可以促进肿瘤细胞凋亡 并抑制其增殖，而对正常组织几乎没有不良影响。RNA干涉(RNA int。rference，RNAi)能够特异、有效地降解mRNA，引起转录后水 平的基因沉默，在小鼠和人的体外培养细胞中成功阻断了基因的 表达，实现了细胞水平的基因敲除。利用RNAi技术能否在体内、 体外成功敲除人肝癌细胞中Survivin基因的表达，诱导肝癌细胞 凋亡、抑制肝癌细胞增殖是本实验的主要内容。 研究目的:探讨Survivin基因在人肝癌细胞增殖和细胞凋亡 中的作用机制，为人肝癌的基因治疗提供理论依据。 实验方法: 1、应用SABC免疫组织化学染色、RT一pCR和western b10t 等技术对87例HCC及其50例癌旁肝组织石蜡标本、8例HCC组织 和4种人肝癌细胞系(HepGZ、SMMC一7721、HHCC、HCC一9724)中 Survivin、P53、Bel一2蛋白和Survivin mRNA以及细胞凋亡进行 检测。 2、通过脂质体介导将Survivin基因转染人肝癌细胞系HopGZ 中，建立稳定表达survivin基因的HepGZ细胞模型(S竹一HepGZ) ;运用SABC免疫组织化学染色、RT一PCR、流式细胞分析(FCM) 以及生长曲线等检测转染前后HepGZ中Survivin蛋白及其mRNA 的表达、细胞周期和细胞生长的变化。 3、通过脂质体介导将Survivin基因的dsRNAi真核表达载体 转染人肝癌细胞系SMMC一7721，建立dsRNAi的SMMC一7721细胞模 型(S一RNAi一7721);运用SABC免疫组织化学染色、RT一PCR、Western blot、FCM分析、TUNEL技术、透射电镜、DNA Ladder分析以及生 长曲线等检测转染前后S翩C一7721中Survivin蛋白及其mRNA的 表达、细胞周期和细胞凋亡、细胞增殖以及细胞生长的变化。 4、以BALB/c裸鼠为研究对象，采用皮下注射H即G2、 Svv一HepGZ和S枷C一7721、S一刚Ai一7721细胞悬液，建立肝癌细胞 第四军医大学博士学位论文 币亩亩.口.亩百百.亩亩亩亩亩亩亩亩亩亩面面面面面面面面.口国面面面面面面亩百口百目面.面面面面口.面面面面面百西面亩亩.亩.面......口亩亩百亩亩..百亩亩亩亩.百.亩口 的裸鼠动物模型;通过测量和称重等方法观察肿瘤形成和肿瘤的 生长状况;采用SABC免疫组织化学染色和RT一PCR检测肿瘤组织 Survivin蛋白及其mRNA的表达。 5、应用Western blot、 TUNEL技术、DNA Ladder分析和FCM 分析等检测抗肿瘤药物表阿霉素在相同浓度(10 pg/ml)不同时 间作用于HepGZ、SVV一HepGZ和SMMC一7721、S一RNAi一7721细胞后， Sury ivin蛋白及其mRNA的表达以及细胞周期和细胞凋亡的变化。 实验结果: 1 .Survivin基因在HCC组织和人类肝癌细胞系表达上调，其 表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、有否转移、Bd一2的表达、组 织分化程度及临床分期等均无相关关系，而与突变型P53的表达 密切相关。 2.转染Survivin基因的HepGZ细胞出现了Survivin蛋白及 其mRNA的表达，成功建立了稳定表达Survivin基因的HepGZ细 胞模型，该细胞模型表现出明显的增殖活性。 3.转染Survivin基因dsRNAi的S枷C一7721细胞，Survivin 蛋白及其mRNA表达消失，成功建立了稳定表达S盯vivin基因 dsRNAi的SMMC一7721细胞模型，该细胞模型表现为Survivin基因 在蛋白水平和转录水平表达受阻，出现细胞凋亡的典型特征，细 胞生长明显受抑。 4.转