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人源性抗角蛋白抗体的高效表达及其作用研究

樊建勇  
【摘要】:研究表明,人体内天然存在的抗角蛋白自身抗体(anti-keratin auto antibody,AK auto Ab)是维持机体免疫状态平衡的重要成员。一些病理情况下(如银屑病、接触性皮炎等),AK auto Ab的存在有利于限制病情的进展,促进损伤的修复,对机体具有有益的保护作用。动物实验和体外研究都提示当机体内AK auto Ab水平低下时,人为补充抗角蛋白抗体有可能成为该类疾病新的治疗措施。 目的: 目的基因的高效表达是制备有应用价值的治疗性抗体的重要前提。抗体除用于基础研究外,还可以在临床诊断和治疗中应用,特别是具有低免疫原性、可以快速到达作用靶点和可迅速清除等优点的小分子抗体。我们利用噬菌体抗体库技术筛选获得了高亲和力、高特异性人源性抗角蛋白抗体。为了提高其产量,我们用大肠杆菌包涵体表达然后体外变性、复性的方法及巴氏毕赤酵母表达等不同方法表达小分子抗角蛋白抗体,以得到高表达的抗角蛋白抗体并为其下一步应用研究打下基础。 方法:实验内容共分为3个部分,操作方法简述如下: 1.抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的包涵体表达与复性 以已构建好的质粒p3MH/Fab为模板,应用PCR技术分别用相应的引物扩增Fd及轻链基因,酶切后分别插入到原核表达载体pET32a相应的酶切位点中,从而构建成Fd及轻链的原核非融合表达载体pET32a/Fd和pET32a/L。转化大肠杆菌BL21(DE3)并通过IPTG诱导其表达,SDS-PAGE电泳检测表达情况。大量制备表达的Fd及轻链后,按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性。然后,分别利用SDS-PAGE电泳、Western-Blot和ELISA对复性产物进行分析和鉴定。 第四军医大学博士学位论文 2.人源性抗角蛋白单链抗体在巴氏毕赤酵母的分泌表达从已构建好的质粒 p3MH/scFv中亚克隆目的片段ScFv并插入酵母表达载体pPICgK上。因子的信号肤 后边,构建成重组质粒pPICgK/SCFv,并测序鉴定。重组质粒pPICgK/SCFv线形化 后电转入酵母菌GSlls,将重组质粒PPICgK/ScFv整合到巴氏毕赤酵母菌GSI巧的 染色体上。经G4 18筛选出基因组中含有高拷贝数外源基因的稳定整合子,经过基 因组PCR鉴定和表型鉴定后,用含0.5%甲醇的培养基诱导其分泌表达。利用 SDS一PAGE、Western一blot和ELISA检测其表达情况及抗原结合特异性。 3.人源性抗角蛋白抗体Fab段在巴氏毕赤酵母的分泌表达从本实验室已构建 好的质粒p3MH/Fab中将目的片段L链和Fd段分别亚克隆到酵母表达载体pPICgK和 pP工CZ QA中,构建成重组质粒pPICgK/L和pPICZ OA/Fd并测序鉴定。重组质粒 PP工CgK/L线形化后电转入酵母菌GSll5,整合到巴氏毕赤酵母菌GSI巧的染色体 上。经G418筛选出基因组中含有高拷贝数外源基因的稳定整合子,经过基因组PCR 鉴定和表型鉴定后,用甲醇诱导其分泌表达并优化表达条件,表达上清用 SDS一PAGE和Western一blot进行鉴定。重组质粒pPICZ oA/Fd线形化后电转整合到 己经整合有L链的酵母菌GSI巧的染色体上,经G418和 Zeocin筛选得到高拷贝转 化子,经过基因组PCR鉴定和表型鉴定后,用甲醇诱导其表达并优化表达条件。 利用sDs一PAGE、western一blot和ELIsA检测其表达情况及抗原结合特异性。表达 产物纯化后,用MTT法和流式细胞仪检测其对培养角质形成细胞生长的影响。 结果: 1.成功构建了Fd及轻链的原核非融合表达载体pET32a/Fd和pET32a/L。转化大 肠杆菌进行诱导表达后,SDS一PAGE电泳和Western Blot分析结果显示:Fd及 轻链均成功获得了高效表达,表达蛋白分子质量均在25KD左右。表达量分别约 占菌体总蛋白的40%和44%,两种目的蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。 复性后产物经SDS一PAGE电泳分析证实:Fd与L在缓慢透析的条件下,成功的复 性为Fab抗体,非还原条件下在约45KD出现新的蛋白条带,而在还原条件时, 新生蛋白条带回复至25KD。Gel一Protein软件分析发现45KD处的复性蛋白占总 蛋白的35%。ELISA及Western一Blot分析证实复性的Fab抗体具有特异性抗原结 合活性。 2.利用PCR从质粒P3阳/ScFv中成功扩增了目的片段ScFv基因,其大小为 750bp,且同时正确引入了相应的酶切位点。酶切鉴定的结果表明人源性抗角蛋 白抗体ScFv基因正确插入到质粒pPICgK中,测序结果表明重组载体中ScFv基 第四军医大学博士学位论文 因序列与已知序列相符合,未发现突变的碱基,且密码子读框正确。应用电转方 法将重组质粒pPICgK/SeFv转化GSlls后,于MD平板上有大量HIS+克隆产生。 进一步将这些阳性克隆进行G418抗性筛选,得到高拷贝转化子。挑取单克隆菌 株,提取酵母DNA,以此为模板进行PCR扩增,得到750bp左右的DNA片段,而 转入空质粒pPICgK的酵母没有扩增得到目的片段,证明重组质粒pPICgK/ScFv 整合入酵母基因DNA组中。将高拷贝转化子点在MM和姗选择平板上,确定其表 型为Mut“。含0.5%甲醇的培养基诱导其分泌表达,15%SDS一PAGE电泳显示,表达 产物在分子量25KD处有一条带,而转入空载体的对照菌未见该条带。SDS一PAGE 电泳结果经Gel一Protein软件分析,经与标准蛋白比较,25KD处产物量约为18.7


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