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当归多糖的组成分析及其激活腹腔巨噬细胞的免疫机制

杨兴斌  
【摘要】:研究目的:当归为伞形科多年生草本植物,是中医内、外、妇、儿各科常用的主药,其主要功能为补血和血、调经止痛,兼有滋补强壮、扶正固本及活血化瘀之功效。当归的主要成分为多糖、阿魏酸、挥发油等。其中,当归多糖是主要水溶性成分,且具有广泛的生物活性,成为当归药效物质基础的研究热点。但多糖研究正面临着质量控制、作用机理等目前亟待解决的“瓶颈”问题。因为多糖是不同分子量大小的混合物,难于质量控制;此外,多糖是大分子化合物,不能透过细胞膜,在胃肠道几乎不吸收,而多糖经口服、腹腔注射、静脉等途径给药均有较好的药效,这提示,多糖可能作用于细胞膜受体而介导免疫应答。但其激活机制还不清楚,主要是还尚未鉴定是哪种膜受体起关键作用。而Toll样受体4(TLR4)是近年发现的重要内毒素脂多糖(LPS)受体,是机体天然免疫系统的重要组成部分,在识别病原体,启动NF-κB通路,促进NO、TNF-α等细胞因子分泌中起关键作用。最新研究表明,几种细菌多糖可作用于TLR4表面分子而激活巨噬细胞、T细胞和B细胞,认为TLR4可能是该多糖的受体。为此,本文针对当归多糖研究中存在的主要问题,拟集中建立当归多糖组成测定的高效液相色谱(HPLC)质控技术,并以小鼠腹 第四军医大学博士学位论文 腔巨噬细胞的TLR4为当归多糖的候选作用靶点(受体),研究中 药植物当归多糖是否通过TLR4介导腹腔巨噬细胞的激活,揭示 当归多糖的作用机理。 研究方法:以崛县当归根为药材,采用水煮、乙醇沉淀、透析、 反复冻融除蛋白、冷冻干燥等方法制备粗多糖,并经葡聚糖凝胶 柱进一步分离纯化为不同的多糖组分。用IR、UV、元素分析、旋 光度等常规分析方法从不同角度反映多糖的纯度、理化性质等基 本特征。在采用目前较成熟的气相色谱(GC)法测定多糖组成的 实验基础上,通过1一苯基一3一甲基一5一毗咪酮(P MP)柱前衍生化高 效液相色谱法,建立常规紫外检测和C,8柱分离分析多糖组成的新 方法。同时,从BALB/c纯系小鼠分离腹腔巨噬细胞,进行原代 细胞培养;采用过氧化氢(HZO:)和叔丁基过氧化氢(tBOOH) 为活性氧(ROs)实验损伤剂(激活剂),建立巨噬细胞损伤模型, 观察当归多糖对ROS激活的巨噬细胞释放NO的影响及其抗损伤 保护效应。此外,采用M竹、紫外可见分光光度法等方法研究当 归多糖对正常巨噬细胞释放细胞因子等免疫活性的影响,并采用 免疫组化、Rl’- PCR等技术研究当归多糖对巨噬细胞诱导型一氧化 氮合酶(iNOS)和TLR4基因表达的影响,揭示多糖作用机理。 实验结果:当归经水提、醇沉、反复冻融除蛋白等方法,成 功地实现多糖的分离纯化;制备的粗多糖CAP呈白色,提取率达 10%以上;为实现均一、药效稳定的目的,CAP进一步经 Sepha卿l一5 400凝胶层析柱(94 X sem)分离纯化为”FI,^PFZ 和APF3三个明显的组分。元素分析、紫外扫描、旋光度测定、分 光光度分析等实验结果表明,该提取工艺得到的当归多糖组分 APFI和妙FZ未发现有蛋白质或核酸等杂质的存在;但CAP及 其组分APF3发现含有少量蛋白质,表明采用本室建立的反复冻融 第四军医大学博士学位论文 除蛋白方法,其除蛋白效果较为理想。药效实验表明,APFI,APFZ 和APF3均有抗氧化损伤、抗肿瘤、激活巨噬细胞等功效,各组分 的生物活性顺序为APF3APFZAPFI。其中,APF3与APFZ活 性相当,但APF3稳定性较差,药效重复性不理想,这可能与其结 合的蛋白等杂质有关,而以APFZ为当归多糖的代表组分进行药效 评价可得到较稳定和理想的结果。 GC分析结果表明,CAP及其组分APFI、APFZ和APF3的单 糖组成摩尔比各不相同。CAP由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、 甘露糖(Man)、葡萄糖(Gle)、半乳糖(Gal)组成,其摩尔比为 1.00:2.72:0.72:4.00:2.32:APFI由Rha、Ara、Gle、Gal组成, 其摩尔比为1.00:2.27:7.80:2.69;APFZ由Rha、Aia、Man、Gle、 Gal组成,其摩尔比为1 .00:5.29:3.66:9.11: 5.17:APF3由助a、 Ara、Man、Gle、Gal组成,其摩尔比为1 .00:4.54:2.98:1 1.09:7.45。 采用PMP柱前衍生化HPLC法,首次成功地实现当归多糖的 单糖组成分析;并建立了当归多糖水解样品及其PMP衍生化样品 的制备优化工艺。本样品制备方法无任何干燥过程,而是将多糖 水解液直接用NaOH中和(约中性),而后溶液直接进行PMP衍 生化,氯仿萃取后的水层溶液进样分析。该方法避免了传统多糖 水解产物的干燥以及PMP衍生化溶液再次干燥的复杂烦琐过程。 这对于发展多糖的定性定量在线分析技术有重要的理论和实际意 义。该制备方法具有如下特点:①简化工艺、避免糖的干燥损失; ②改进后的样品制备工艺,节约2/3的时间,而对多糖的组成测 定无影响;③可用于多糖和单糖的在线大批量定性定量分析监 测。HPLC分析结果表明,CAP由甘露糖(Man)、鼠李糖(灿a)、 葡糖糖醛酸(GleUA)、半乳糖醛酸(GalUA)、葡萄糖(Gla)、半 乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)七种单糖组成,其摩尔比为0.57:1.00: 0 .13:3 .06:8.16:7.17:12.69;APFI由Rha、GalUA、Gle、Gal、 Ara五种单糖组成,其摩尔比为1.00:2.65:2.02:3.45:10.64;’APFZ 第四军医大学博士学位论文 由Man、


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