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慢性粒细胞白血病的基因治疗研究

王莎  
【摘要】:慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML),简称慢粒,是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病。现在认为携带有bcr-abl融合基因的Ph染色体是慢粒发病的关键因素,它赋予Ph阳性克隆起源的造血细胞具有大大优于正常造血细胞的增殖能力和存活能力。Ph染色体是人类肿瘤细胞中发现最早的畸变染色体,由位于第9染色体的c-abl原癌基因与第22号染色体bcr基因相互易位形成bcr-abl融合基因,编码分子量为210 KDa的P210~(bcr-abl)或BCR-ABL融合蛋白,构成慢粒特征性的分子生物学标志。bcr-abl融合基因的致白血病性主要因为P210~(bcr-abl)蛋白具有失调的酪氨酸激酶活性,导致造血细胞产生过度增殖,对骨髓基质的粘附性下降以及凋亡丧失等病理学改变。 在慢粒的传统治疗方法中,造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)和α-干扰素使慢粒的预后得到很大改观。随着对慢粒分子病因病理学认识的深入,逐渐开辟了针对bcr-abl融合基因及P210~(bcr-abl)融合蛋白的特异性分子靶向治疗的新 第四军医大学博士学位论文 思路。特异性抑制PZ 1 obcr.abl蛋白激酶活性的sn 571问世,堪称 是慢粒治疗的一个里程碑。然而,无论是反义核酸和核酶,还是革 命性的STI 571,均不能彻底治愈慢粒。反义核酸和核酶的作用效 率以及反义核酸的非特异性毒性作用都受到质疑:STI 571也面临 着复发和耐药等问题,其远期效果如何,尚待进一步的临床观察才 能作定论。 2001年12月21日出版的Science将“RNA干涉”列为2001 年科学十大突破之一。RNA干涉(RNAin沈川免~e,RNAi)是将 双链RNA(dsRNA)导入细胞,引起特定基因的mRNA降解的一 种反应过程,属于转录后基因沉默(妙st.tr出”criPtional gene silencing,PTGs)。洲A干涉技术就是人为地引入与靶基因具有同 源序列的双链RNA(doubl卜stranded RNA,dsRNA),诱导内源靶 基因的mRNA降解,达到阻止基因表达的自的。RNA干涉技术具 有高特异性、高效率和高成功率等优点。目前,RNA干涉技术在 哺乳动物和人类中的应用成为生物学和医学研究的热点问题之一。 在过去几年中,人们己经开始将RNA干涉技术用于临床治疗的实 验研究,例如病毒感染性疾病、肿瘤和其他一些显性遗传性疾病。 因此,作者设想:应用RNA干涉技术特异地抑制bcr-abl基因的表 达,可能为慢粒又提供了一个有效的治疗手段。 此外,长期的临床实践表明:应用任何一种单一的制剂都不 足以彻底治愈慢粒这一恶性血液病,多种治疗策略联合应用和不断 发掘新的墓因治疗靶点仍是慢粒治疗的一个重要原则。尽管 BCR.ABL是反义治疗的最具吸引力的作用目标,但这一蛋白的半 衰期很长,难以被完全抑制,因此有的研究者开始关注BCR.ABL 融合蛋白下游的一些信号分子,例如,MYC、CRKL、GRBZ、EJT、 4 第四军医大学博士学位论文 VAV和MYB。CRKL是以BCR.ABL蛋白为核心的信号通路网络 中的一个重要的接头蛋白,是BCR一ABL酪氨酸激酶的重要底物之 一。由于CRKL通过其SH 2 domain和SH 3 dom目Ln募集各路信号 转导分子,介导慢粒白血病细胞内多条信号转导通路,因此有人把 它形象地称为“多米诺骨牌”中的一个开关。本文作者在硕士研究生 期间对CRKL基因在慢粒发病中的作用做了初步研究,发现该接 头蛋白具有原癌的潜质,可以促进慢粒白血病细胞过度增殖。因此 作者设想:同时封闭crkl基因和ber一abl融合基因的表达,或许比 单用其中任一制剂会取得更好的治疗效果。 基于慢粒所具有的独特的细胞遗传学特征和以此为依据的特 异性分子靶向治疗所取得的重大突破,本实验旨在利用一个新近发 现的、强有力的基因千预技术一RNA干涉,对be卜abl融合基因的 表达进行干预,观察其对慢粒白血病细胞生物学特性的影响;同时 抑制BCR.ABL融合蛋白下游的一个重要信号分子CRKL的表达, 观察两者有无协同作用,希望能为RNA干涉技术用于慢粒的临床 治疗提供实验依据。 本实验以慢性粒细胞白血病细胞系KS似作为研究对象,该细 胞转录b3:a2型be卜ab!mRNA。本实验化学合成了针对b3:a2型 be卜abl融合基因的Zlni互补双链RNA序列,以脂质体为介质转 染K562细胞,应用Northem blotting和Westem blotting法检测 ber.abl融合基因的表达情况,应用3H一TdR掺入法检测K562细胞 的增殖活性、AnnexinV一FITC/Pl染色法睑测K562细胞的存活 状况、流式细胞仪法检测K562细胞的周期变化以及联苯胺染色法 检测K562细胞的分化状况,并检测了两个凋亡相关基因 Bcl一x声ax的表达变化。在此基础上,本实验用JH一TdR法观察 联合应用be卜abl融合基因特异性的siRNA和crld基因反义寡核昔 酸对K562细胞增殖活性的影响。 第四军医大学博士学位论文 本研究的主要实验结果如下: .westemblotting检测结果发现:与对照组相比,RNA干涉组 K562细胞BCR-ABL融合蛋白的表达明显下降。 .Northemblotting检测结果表明:与对照组相比,RNA干涉组


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