鸦胆子油乳对膀胱癌细胞系BIU-87增殖的影响及其机制的初步研究

【摘要】：膀胱癌是我国泌尿生殖系统中发病率最高的恶性肿瘤，其中大部分是浅表性膀胱癌，目前多采用经尿道膀胱肿瘤切除或膀胱部分切除，术后为预防复发多配合膀胱灌注治疗，目前常用的药物为卡介苗、丝裂霉素C、羟基喜树碱等。 鸦油乳是我国沈阳药科大学自行研制的中药制剂，自上世纪七十年代末应用临床治疗肿瘤以来，显示了良好的抗癌效果。对于膀胱肿瘤，鸦油乳灌注治疗具有复发率低，副作用小，病人容易耐受等优点。 因此研究鸦油乳的作用机制对治疗膀胱癌具有十分重要的意义，本课题观察了不同浓度鸦油乳对体外培养的膀胱癌细胞株BIU-87增殖的影响，初步探讨其可能的作用机制，同时观察其对BIU-87细胞的运动能力和侵袭力的影响。 采用MTT法检测不同浓度鸦油乳作用不同时间对BIU-87细胞的抑制作用，进行药物敏感性试验，估算鸦油乳对肿瘤细胞的半数抑制浓度IC_(50)；利用PI(碘化丙啶)、Hoechst 33342进行染色，荧光显微镜观察，用Armexin V-FITC凋亡检测试剂盒经流式细胞仪检测不同浓度鸦油乳作用后BIU-87细胞坏死和凋亡的比例；用Rhodamine 123染色经流式细胞仪检测鸦油乳作用早期线粒体膜电位的变化，利用细胞色素c抗体和OMP25抗体进行免疫荧光双标记，激光共聚焦显微镜观察低浓度鸦油乳作用前后细胞色素c的分布；低浓度鸦油乳作用12h后，RT-PCR检测细胞procaspase-3 mRNA水平；低浓度鸦油乳作用36h后，用抗procaspase-3及其亚基的多克隆抗体，westem blot检测caspase-3 第四军医大学硕士学位论文 的活化:利用MIllieell小室和Boyden小室检测鸦油乳对BIU一87细胞 体外侵袭力和运动能力的影响。 实验结果:不同浓度鸦油乳作用后，BIU一87细胞增殖受到抑制， 其抑制作用有浓度及时间依赖性，根据对48h组作图估算ICS。值大约 为6mL/L;不同浓度鸦油乳作用24h、36h后，流式细胞术结果提示低 浓度下(5 mL/L)凋亡细胞比例较高，与对照组差异有统计学意义，高浓 度(2 0.OmL/L)鸦油乳作用后细胞死亡方式以坏死为主，其坏死细胞比例 与对照组差异有显著意义;进一步检测线粒体跨膜电位发现，不同浓 度鸦油乳作用后均可明显降低线粒体跨膜电位，高浓度组降低更为显 著;激光共聚焦图像显示正常对照组细胞色素c与OMP25分布类似， 低浓度鸦油乳作用后两者分布不同，提示细胞色素c自线粒体释放至胞 浆;Rl’- pCR结果提示对照组ProcasP一ase mRNA表达很弱，5 mL/L鸦 油乳作用12h后，proeaspase一3 mRNA水平略有升高;westem blot结果 显示smL/L鸦油乳作用36h后，检测到procaspase及大亚基的表达， 提示casPase一3的活化;1 mL/L鸦油乳作用4h后，Boyden小室染色观 察并计数，结果提示穿过小室的细胞数较对照组减少，差别有统计学 意义，侵袭力实验得到类似结果，提示可抑制BIU一87细胞体外运动能 力，降低其侵袭力。 以上结果提示，鸦油乳对体外培养的膀肤癌细胞系BIU一87有明显 的抑制作用，可诱导肿瘤细胞发生坏死与凋亡，其中低浓度组凋亡细 胞比例较高，而高浓度组坏死细胞比例较高。低浓度鸦油乳可诱导 BIU一87细胞线粒体膜电位降低，细胞色素c释放，procaspase一3 mRNA 转录略有增强，caspase一3活化等，提示鸦油乳可能通过线粒体途径诱 导BIU一87细胞发生凋亡。其具体分子机制尚不清楚。另外，我们的实 验还发现鸦袖乳可抑制BIU一87细胞的体外运动及侵袭能力。