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~(99)Tc~m直接法标记Angiostatin及其在荷瘤小鼠体内研究

张金赫  
【摘要】:恶性肿瘤的生长具有血管生成依赖性。原发肿瘤的生长,浸润和转移均需要新生血管,因而,肿瘤的抗血管生成治疗是近年来肿瘤治疗研究中的一个热点。但是,抗血管生成治疗也存在一些尚未解决的问题,如对于病例的选择,尚无确切的方法获知那些病人可在抗血管生成治疗中获益,同时,对于抗血管生成治疗的疗效监测也缺乏无创、敏感的方法。自从1994年O'Reilly等发现血管抑素(Angiostatin,AS)以来,因为它强大的抗血管生成作用和抗肿瘤转移作用,而受到了人们极大关注。目前的研究已显示其具有重要和潜在的临床应用价值。本研究用~(99)Tc~(?)标记AS,试图建立一种血管生成的监测方法,用于评价肿瘤抗血管生成治疗疗效,同时为AS的进一步深入研究提供一种强有力的工具。 目的: 探索用~(99)Tc~(?)直接标记血管抑素(Angiostatin, As)的方法,并研究标记产物的体外稳定性及其生物活性。观察其在荷瘤小鼠体内的生物分布并进行显像,以探讨其在肿瘤阳性显像及监测肿瘤抗血管生成治疗疗效中的应用价值。 方法: 第四军医大学硕士学位论文 1、制备的AS经鉴定后,分别用2一琉基乙醇(2一砚)和氯化亚锡(Sncl:) 还原法进行标记,并用正交设计筛选最佳合成条件。 2、对标记产物用纸层析法测标记率及S即hadexG一50层析柱进行鉴 定:纸层析法支持体为新华I号滤纸,展开剂为生理盐水,Rf值: 钾。.--As=0 .0,得胶体=0 .0,99Tc,04一=1 .0。 3、产物中分别加入牛血清白蛋白(BSA)、生理盐水及不同摩尔比的 半肤氨酸(Cys)以观察其体外稳定性; 4、用人脐静脉内皮细胞系ECV304,通过血管内皮细胞生长抑制试验, 来检测卯介m-AS的生物活性。 5、组织分布研究及闪烁扫描显像研究:为了明确99Tc’一AS与肿瘤的 结合是否存在竞争性抑制作用,我们进行了封闭实验。在给药前2h用未 标记AS预处理荷乳腺癌EM几瘤株的Bal b/C小鼠,生理盐水作为对照, 显像剂99Tc一AS尾静脉注射,在不同时间点观察其体内分布并进行显像。 6、统计学方法:均数的显著性检验用t检验,方差分析等,具体计 算用统计学软件SPSS来进行:在筛选最佳合成条件时,用到了正交设计。 结果: 1、2一拢法最佳标记条件为AS100”g,PB(0.5 ool.L一,,pH7.3) lml,2一她100 pg,MDP(用lml生理盐水溶解)10 pl,加入99Te,04一185珊q, 标记率可达97士1.5%:snelZ法为As一00协g,翻酸缓冲液(0.1 mo 1 .L一,, pHg,0)lml,ZOg.L一‘snC12(1 mol.L一’盐酸作为溶剂)20 pl加入珊P 药盒,用去氧水稀释至1耐,取20 pl,加入衡c似一185拙q,标记率可达 90士3 .0%。 2、产物在109/l BsA中6小时后标记率下降了既,在生理盐水中则 下降了1.5%;在不同摩尔比半肤氨酸溶液中,99Tc.--As中妈Tc’存在不同程 度解离,摩尔比在5以下时,用TLc法在水介质中测标记率仅下降器, 表明产物在体外稳定。 4 第四军医大学硕士学位论文 3、用不同浓度的99Tc’一AS与AS处理人脐静脉内皮细胞系(ECV304), 并以6一氨基己酸作为对照,结果表明二者对内皮细胞生长的抑制作用未 见显著性差异(p二0.84)。 4、在荷瘤小鼠体内分布研究结果显示:封闭组及未封闭组小鼠脏器 的放射性分布除肿瘤以外,均随时间延长而下降。在肝和肾摄取较高,肺、 肌肉摄取较少。在用未标记AS进行预处理组,组织放射性分布多数降低, 而肝、肌肉有所升高,在注药4h后,血液、小肠、心脏、肝、肺、肿瘤 等放射性分布差异有显著性(p0.05);24h后,心、肾、肿瘤放射性分 布差异有显著性(p0 .05)。 5、闪烁显像表明肿瘤在6一12h可获较好影像。体内阻断研究表明, 在用非标记AS预处理后,摄取会降低。在6h全身平面静态显像图上,用 ROI技术勾划瘤区和对侧非瘤肌肉区,计算T/NT比值。在封闭组和未封 闭组,T/NT比值(瘤/非瘤区计数比)分别为1.80+0.03和2.62+0.04, 封闭组的摄取较未封闭组低32%(t二3.67,p0.01,V二8)。 结论: 用99Tc’直接法标记AS简单高效,且对AS生物活性无明显影响。 钾c’一As在荷瘤小鼠体内可浓聚于肿瘤,而且具有竞争性抑制作用: ”Tc.--As有可能在肿瘤血管生成显像及抗血管生成治疗疗效评价中发挥作 用。


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