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耐药结核分枝杆菌基因突变热点筛查与检测技术平台的建立

王琰  
【摘要】:结核分枝杆菌耐药性的产生,给结核病的治疗和预防控制带来了巨大的困难,使结核病患者的数量在全世界范围有所回升。目前的研究表明,结核分枝杆菌基因组中基因突变所引起的耐药性是结核分枝杆菌产生耐药的主要机制。系统筛查分析我国结核分枝杆菌耐药相关基因突变类型及分布特点,可深入揭示国人耐药性结核病的发生机理,也为结核病耐药性基因诊断提供理论依据。临床上对于结核分枝杆菌耐药性的诊断主要采用基于培养基础上的药敏检测方法。由于诊断耗费时间较长,使许多患者缺乏及时的诊断和有效的治疗而病情加重。利用分子生物学方法诊断分析药物敏感性,目前主要有PCR-SSCP、PCR-RFLP和DNA测序等技术,但这些技术的实验要求高或存在其它各种局限,不适于临床广泛应用。因此,开发一种新的分子生物学诊断技术已成为当务之急。 第四军医大学硕士学位论文 为建立二种高通量、低成本、方便快速的结核分枝杆菌耐药 相关基因突变筛查技术平台,本研究构建了结核分枝杆菌rP口B, rpsL,embB和katG四种基因的野生型重组质粒,建立并优化了 PCR扩增条件、单链DNA模板的制备条件和焦磷酸测序分析的 参数。并应用焦磷酸测序技术平台对临床82例耐药结核分枝杆 菌分离株的四种基因突变热点进行筛查分析。研究结果表明,焦 磷酸测序技术平台完全可以用于结核分枝杆菌耐药相关基因高 突变区域点突变的微测序筛查分析研究;突变筛查结果表明,在 耐药的菌株中存在不同程度的突变,kalG了I万、rP口B万2‘、rPoBJ了I 和embB3口百基因位点的突变频率与文献报道比较相符,未筛查到 毕sL了3基因位点的突变,而rPsL88基因位点的突变频率稍高于 文献报道。突变筛查还发现一种新的基因突变位点rP口B刀7CAG 一TAG,和一种新的基因突变形式。mbB了O百ATG一AGG。研究结 果提示rPoB,rPsL,。mbB和katG等基因的点突变是结核分枝杆 菌产生耐药性的根本原因之一。突变筛查结果对结核分枝杆菌耐 药性基因诊断方案的建立具有重要的指导意义。 为建立一种适合临床应用的结核分枝杆菌耐药性基因诊断 技术,我们根据Pyrosequencing突变筛查结果,选取了结核分枝 杆菌kazG3jJ、毕oB万2‘、毕oBJ了l、embB了O‘和,sL88作为待分 析基因位点,构建了以上基因位点的突变型和野生型重组质粒, 建立并优化了TDI一FP技术的实验参数与条件。应用重组质粒作 为标准对照样品,我们对经过焦磷酸测序筛查的样品进行TDI一FP 分析。研究结果表明TDI一FP技术进行点突变分析具有较高的准 确性和可靠性,并具有操作简便快速、检测费用低和自动化等优点, 适用于结核分枝杆菌耐药相关基因点突变的临床诊断分析,在结 核病患者耐药临床诊断及临床指导用药中具有很大的应用前景。


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